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Previous issue date: 2017-04-28 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Unlike most other tumors, the incidence of malignant cutaneous melanoma has increased in the last 30 years. This is responsable for 75% of skin cancer deaths. Many molecular pathways involved in melanomogenesis have already been identified. However, there is still no chemotherapy protocol that guarantees long-term life expectancy. Nitrostyrene compounds are related to antitumor activities since 1975, however, there are no reports of this efficacy on melanoma. In vitro and in vivo antineoplastic effects of the synthetic nitrostyrene derivative 4-chloro-1-nitro-2-phenylethene (7E) were tested in several cell lineages, especially melanoma (SK-Mel-3 and B16F10). Cell viability was assessed by the Alamar Blue® test. Cell cycle, apoptosis, reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial depolarization were evaluated by flow cytometry. Caspases 9 and 3, JNK, p38, Bcl-2 and ERK expressions were determined by western blotting. We performed the murine melanoma model to verify the efficacy and toxicity in vivo. Our observations indicate that 7E is cytotoxic to several neoplastic lines, especially melanoma, IC50 of 3.13 μg/mL in SK-Mel-3 and 1.48 μg/mL in B16F10. We found out that 7E increased the level of intracellular reactive oxigen and nitrogen species (ROS/RNS). Furthermore, it increased expression of JNK, p38 and ERK, and reduced expression of Bcl-2. This leads to mitochondrial depolarization, possibly permeabilization of the outer membrane of the mitochondria and the release of cytotoxic proteins (DIABLO / Smac, AIF, ENDOG and CYTC), and the activation of caspase-9 and caspase-3, resulting in apoptotic cell death. The effects of 7E are antagonized by antioxidant pretreatment, confirming the unequivocal importance of increased ROS/RNS in this process. 7E also suppressed in vivo tumor growth by up to 47.8% under the tested conditions. The systemic toxic effect investigation revealed few significant alterations, highlighting the increase of serum urea biochemical dosage. There were no relevant changes in body mass, organ mass and haematological parameters. Tumor histology revealed necrosis and inflammation with microabcess areas, as well as invasion of adipose tissue with phagocytic reaction in animals treated with 7E. Animals treated with 7E had moderate hepatic alterations including necrosis, degeneration and congestion, renal alterations such as focal congestion, hemorrhage and glomerular sclerosis, reduction of the occurrence of pulmonary metastasis and maintenance of the architecture and normal cardiac morphology. Our findings suggest that 7E may have the potential to be further developed as an anticancer compound, especially for melanoma. / Diferente da maioria dos outros tumores, a incidência de melanoma cutâneo maligno vem aumentando nos últimos 30 anos. Esse subtipo de neoplasia é responsável por 75% das mortes por câncer de pele. Muitas vias moleculares envolvidas na melanomogênese já foram identificadas. No entanto, ainda não há um protocolo quimioterápico que garanta expectativa de vida a longo prazo. Compostos nitroestirenos são relacionados a atividades antitumorais desde 1975, no entanto, não há relatos dessa eficácia sobre o melanoma. A atividade antineoplásica in vitro e in vivo do derivado nitroestireno sintético 4-cloro-1-nitro-2-fenileteno (7E) foi testada em diversas linhagens celulares, com destaque para as de melanoma (SK-MEL-3 e B16F10). A viabilidade celular foi avaliada pelo teste de Alamar Blue®. Ciclo celular, apoptose, acúmulo de espécies reativas de oxigênio e despolarização mitocondrial foram avaliadas por citometria de fluxo. A expressão de caspases 9 e 3, JNK, p38, Bcl-2 e ERK foram determinadas por western blotting. E a eficácia e toxicidade in vivo foram verificadas em modelo de melanoma murino. Nossas observações experimentais indicam que o composto 7E é citotóxico sobre diversas linhagens neoplásicas, sobretudo as de melanoma, com CI50 de 3,13 μg/mL em SK-MEL-3 e 1,48 em B16F10. O composto induz ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs/ERNs), causando aumento da expressão de JNK, p38 e ERK e redução da expressão de Bcl-2. Isso leva à despolarização mitocondrial, provável permeabilização da membrana externa da mitocôndria e liberação de proteínas citotóxicas (DIABLO/Smac, AIF, ENDOG e CYTC), ativação de caspase-9 e caspase-3, resultando em morte celular por apoptose. Os efeitos de 7E são antagonizados pelo pré-tratamento com antioxidante, confirmando a inequívoca importância do acúmulo de EROs/ERNs nesse processo. 7E possui ainda efetiva ação in vivo promovendo inibição do crescimento tumoral de até 47,8% do volume nas condições testadas. A investigação do efeito tóxico sistêmico revelou poucas alterações significativas, destacando-se a elevação bioquímica da dosagem sérica de ureia. Não foram observadas alterações relevantes de massa corporal, massa dos órgãos e parâmetros hematológicos. A histologia do tumor revelou necrose e inflamação com áreas de microabcesso, além de invasão de tecido adiposo com reação fagocitária nos animais tratados com 7E. A histologia dos órgãos dos animais tratados com 7E revelou alterações hepáticas moderadas incluindo necrose, degeneração e congestão, alterações renais como congestão focal, hemorragia e esclerose glomerular, redução da ocorrência de metástase pulmonar e manutenção da arquitetura e morfologia cardíaca normal. Sendo assim, 7E tem potencial para ser desenvolvido como agente quimioterápico, sendo necessário mais estudos pré-clínicos e clínicos, que confirmarão sua utilidade na terapia antitumoral, sobretudo sobre o melanoma.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/6395 |
| Date | 28 April 2017 |
| Creators | Jobim, Gleyce dos Santos Barbosa, 92-98118-4129 |
| Contributors | ppgif@ufam.edu.br, Vasconcellos, Marne Carvalho de |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Inovação Farmacêutica, UFAM, Brasil, Faculdade de Medicina |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
| Relation | -8624664729441623247, 500 |
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