Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-10-17T03:19:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347966.pdf: 2720589 bytes, checksum: 4de950d1ea96eee16d2f573fe9b0cfaa (MD5) Previous issue date: 2016 / O Melanoma é encontrado na camada basal da epiderme, e consiste em uma neoplasia maligna dos melanócitos. As mutações frequentemente encontradas em pacientes com câncer são do tipo B-RAF e N-RAS. Neste sentido, ter como alvo mutações que são super expressas em linhagens tumorais de melanoma é extremamente importante para melhorar a eficiência dos tratamentos. Anos atrás medicamentos foram aprovados para auxiliar o tratamento do melanoma, porém limitações foram mostradas por pacientes como efeitos colaterais e resistência aos medicamentos. Em 2014, a FDA (Food and Drug Administration) aprovou uma nova estratégia para tratamento de melanoma, o pembrolizumabe, o qual é baseado em um anticorpo monoclonal contra a proteína 1 (PD-1) relacionada a morte celular programada. Recentemente, em 2016 a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) aprovou o uso do medicamento Tafinlar (dabrafenibe), um novo tratamento oral para pacientes com melanoma metastático ou irressecável, oriundo de mutação positiva dos genes BRAF V600E. Embora o tratamento de melanoma tenha tornado-se um grande desafio a superar, este trabalho tem como objetivo ampliar as possibilidades terapêuticas para o melanoma, prospectando novas moléculas ativas. Especificamente, avaliou-se o potencial antitumoral e antiangiogênico de um novo complexo mononuclear de Ga(III) com ligante não-simétrico em linhagens celulares de melanoma humano (SK-MEL-28 e SK-MEL-147) com diferentes mutações e linhagem imortalizada de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). O ligante não-simétrico H3LM3 e o complexo mononuclear de H3LM3 Ga apresentaram CC50 (concentração do composto que causa 50% de morte celular) entre 5 e 25 µM quando expostas as linhagens tumorais, similarmente ativos quando comparados ao vemurafenibe, um quimioterápico de referência. Quando as CC50 destes composos foram avaliadas em linhagens tumorais e não tumorais, não foi observada citotoxicidade para a linhagem celular não tumoral, em que 80% de células viáveis foram detectadas. Em relação a ação dos compostos sobre a atividade de caspases, os dados demonstram que não houve aumento da atividade de nenhuma das caspases, uma indicação de que a morte celular foi independente de caspases. De acordo com os resultados de um conjunto de ensaios específicos pode-se sugerir que o efeito citotóxico e antiproliferativo se dá através da indução de estresse oxidativo. Adicionalmente, foi mostrado que os compostos apresentaram atividade antimetastática, ao inibir a proliferação e invasão celular, bem como a propriedade de bloqueio da angiogênese. O complexo mononuclear de H3LM3 Ga sobre linhagem tumoral SK-MEL 28 apresentou a redução da expressão do gene VEGF em aproximadamente 20% em comparação ao controle. Concluindo, os compostos testados não somente apresentaram atividade citotóxica significativa, como também demonstraram efeitos anti-metastático e antiangiogênico in vitro/in vivo. De acordo com os dados obtidos, demonstra-se uma nova linha na exploração da atividade biológica de promissores agentes antitumorais.<br> / Abstract : Melanoma is found in the basal layer of the epidermis and consists in a malignant tumor of melanocytes. Mutations often found in patients with cancer are B-RAF and N-RAS type. Thus, targeting mutations which are super expressed in tumor melanoma strains are extremely important to improve the treatment efficacy. Years ago drugs were approved to help the melanoma treatment, however, some limitations were shown by patients such as side effects and drug resistance. In 2014 the FDA (Food and Drug Administration) approved a new strategy to treat melanoma, the pembrolizumab, which is based on a monoclonal antibody against protein 1 (PD-1) related to programmed cell death. Recently, in 2016 the National Agency of Sanitary Surveillance (ANVISA) approved the use of the drug Tafinlar (dabrafenib), a new oral treatment for patients with metastatic or unresectable melanoma, from a positive mutation of BRAF V600E genes. Although the melanoma treatment became a great challenge to overcome, this work aims to broaden the therapeutic possibilities for melanoma by prospecting new active molecules. Specifically, antitumor and antiangiogenic potential of a novel mononuclear Ga(III) complex with the non-symmetric ligand in human melanoma cell lines (SK-MEL-28 and SK-MEL-147) was assessed with different mutations and immortalized lineage of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The non-symmetric linker H3LM3 and the mononuclear H3LM3 Ga complex showed CC50 (compound concentration causing 50% cell death) between 5 and 25 µM when exposed to tumor strains, similarly actives when compared to vemurafenib, a reference chemotherapeutic. When CC50 of these compounds were evaluated in tumoral and non-tumoral cell lines, they did not show cytotoxicity to the non-tumor cell line, in which 80% of viable cells were detected. Regarding the action of the compounds on the activity of caspases, the data demonstrated that there was no increase in the activity of any of the caspases, assuming that cell death was independent of caspases. According to the results of a specific set of tests the cytotoxic and antiproliferative effects occur by the induction of oxidative stress was suggested. In addition, the compounds exhibited anti-metastatic activity, inhibiting cell proliferation and invasion, as well as blocking angiogenesis. The mononuclear H3LM3 Ga complex on SK-MEL 28 tumor line showed a reduction of VEGF gene expression by approximately 20% compared to control. In conclusion, the compounds tested not only showed significant cytotoxic activity but also demonstrated in vitro/in vivo anti-metastatic and antiangiogenic effects. According to the data obtained, a new line in the exploration of biological activity as promising antitumor agents was evidenced.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-12-05T03:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349061.pdf: 3005507 bytes, checksum: a29b38fab534d7f675c6c6b3e5dd0eb6 (MD5) Previous issue date: 2017 / O câncer representa um problema de saúde mundial. Apesar dos constantes esforços e significativos avanços na pesquisa e desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos, a recidiva da doença devido à heterogeneidade do tumor e a resistência aos quimioterápicos permanece sendo um grande desafio na busca pela cura. Nesse contexto, os sais de isotiourônio vêm chamando atenção por diversas atividades biológicas, entre elas promissora atividade antitumoral. Em estudo anterior desenvolvido por nosso grupo de pesquisa foram testadas 28 moléculas com potencial atividade antitumoral, entre as quais se destacou o sal de isotiourônio brometo de (Z)-2-(isotioureidometil)-2-pentenoato de metila (SI-MF08) por apresentar significativa citotoxicidade em linhagem tumoral in vitro e um mecanismo de ação de morte celular que parece ativar diferentes sinalizações que levam à morte da célula tumoral. Esta ação multialvos pode vir a ser uma vantagem na busca por um futuro fármaco, possibilitando contornar a resistência ao tratamento desenvolvida por células tumorais. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a citotoxicidade do SI-MF08 in vitro e realizar estudos pré-clínicos para avaliar a potencial atividade antitumoral. O primeiro capítulo deste trabalho mostra os estudos em linhagem celular de leucemia e mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade do composto. Foi possível compreender que a molécula atua ativando a via extrínseca da apoptose via receptor de membrana Fas e ativação de caspases -8 e -3, além de causar bloqueio mitótico em fase G2/M do ciclo celular e geração de espécies reativas de oxigênio que leva ao estresse de retículo endoplasmático e perda do potencial de membrana mitocondrial. O estresse oxidativo gerado causa danos irreversíveis nas mitocôndrias levando à ativação de formação de vesículas ácidas para eliminação dessas organelas no intuito de reestabelecer a homeostasia da célula. O segundo capítulo do trabalho teve como objetivo avaliar a atividade citotóxica do composto em linhagem celular de melanoma para posterior aplicação em modelo de melanoma in vivo. Observou-se que o SI-MF08 também apresentou citotoxicidade para a linhagem celular de melanoma e o mecanismo de morte envolvido no processo foi semelhante ao encontrado nos resultados do primeiro modelo. O terceiro capítulo do trabalho refere-se aos estudos de citotoxicidade do composto em camundongos na busca pela dose máxima que não apresenta efeitos significativos. Dessa forma, observou-se no estudo de dose única que a dose limite para ser administrada é de 15 mg/kg do composto. Em seguida, no estudo de doses repetidas de 10 dias observou-se que a dose de 12 mg/kg de SI-MF08 representa a dose máxima de trabalho. O quarto capítulo deste trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antitumoral do SI-MF08 em camundongos portadores de melanoma. Os animais administrados com a dose de 7,5 mg/kg do composto não apresentaram os efeitos deletérios da doença como perda de peso e anemia, contudo a dose não foi capaz de melhorar a sobrevida desses animais ou reduzir significativamente o crescimento tumoral. Entretanto a dose de 12 mg/kg não só inibiu os efeitos deletérios da doença como também aumentou a taxa de sobrevida desses animais e reduziu significativamente o crescimento tumoral, de acordo com padrões de institutos internacionais de pesquisa em câncer. / Abstract : Cancer is a global health problem. Despite the efforts and significant advances in the research and development for new chemotherapeutic agents, recurrence of the disease due to tumor heterogeneity and chemotherapy resistance remains a major challenge in the search for the cure. In this context, isothiouronium salts have been attracting attention due to its several biological activities, among those is the promisor antitumor activity. In a previous work performed by our research group, 28 molecules with potential antitumor activity were tested. Among those, the isothiouronium salt methyl (Z)-2-(isothioureidomethyl)-2-pentenoate hydrobromide (IS-MF08) displayed significant cytotoxicity in tumoral cell line and a mechanism that seems to triggers different signals that lead to tumoral cell death. This multi-targeting mechanism may be an advantage in the search for a future drug, making possible to circumvent the resistance to treatment developed by tumor cells. Thus, the objective of this work was to characterize the cytotoxicity of IS-MF08 in vitro and to perform preclinical studies to evaluate the potential antitumor activity. It made possible to understand that the molecule activates the extrinsic pathway of apoptosis via Fas membrane receptor and further activation of caspases -8 and -3, causing mitotic block in the G2 / M phase of the cell cycle and generation of reactive oxygen species that leads to endoplasmic reticulum stress and loss of mitochondrial membrane potential. The oxidative stress generated causes irreversible damage in the mitochondria, leading to the activation of acid vesicles formation in order to eliminate these organelles and reestablish the homeostasis of the cell. The second chapter of the study aimed to evaluate the cytotoxic activity of the compound in melanoma cell line to later application in in vivo melanoma model. IS-MF08 also showed to be cytotoxic to melanoma cell line and the mechanism of death involved in the process was similar to that founded in the results of the first model. The third chapter of the work refers to the cytotoxicity studies of the compound in mice in the search for the maximum dose that has no significant effects. Thus, it has been observed in the single dose study that the dose limit of the compound to be administered is 15 mg/kg. Following, in a 10-day repeated dose study, it was observed that 12 mg/kg of IS-MF08 represents the maximum working dose. The fourth chapter of this work aimed to evaluate the antitumor activity of IS-MF08 in melanoma bearing mice. Animals that were administered with the dose of 7.5 mg/kg of the compound did not exhibit the deleterious effects of the disease as weight loss and anemia, however the dose was not able to enhance the survival rate of these animals or even reduce tumor growth significantly. However, the dose of 12 mg/kg not only inhibited the deleterious effects of the disease but also increased the survival rate of these animals and significantly reduced tumor growth, according to the standards of international cancer research institutes.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-25T03:10:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 342281.pdf: 3917692 bytes, checksum: 553502147fd443b69253761feabb6bab (MD5) Previous issue date: 2016 / Introdução. Evidências indicam um promissor efeito antitumoral das quinonas juglona, fenilaminonaftoquinona-7 (Q7) e fenilaminonaftoquinona-9 (Q9), especialmente quando associadas ao ascorbato. Objetivo. Dar continuidade aos estudos sobre o efeito antitumoral das naftoquinonas juglona, Q7 e Q9 em associação ao ascorbato de sódio, bem como avaliar a melhor associação para o tratamento do câncer a partir dos efeitos obtidos in vitro e in vivo. Metodologia. Foram analisados os efeitos das quinonas juglona, Q7 e Q9 associadas ou não ao ascorbato de sódio sobre o CT-DNA (Calf Thymus-DNA). Em células MCF-7 (carcinoma de mama) foram avaliados a viabilidade celular, os níveis de EROs intracelular, os danos ao DNA e a proliferação celular. Proteínas oriundas dos lisados de células MCF-7 foram utilizados para os ensaios de imunoeletroforese para verificar a integridade da proteína poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), gama-H2AX (?H2AX) e pAkt. A atividade antitumoral in vivo das quinonas associadas ou não ao ascorbato de sódio foi inicialmente analisada através de parâmetros de sobrevida e crescimento tumoral de camundongos portadores do tumor ascítico de Ehrlich. Posteriormente, amostras do tumor foram coletadas e utilizadas para análise de marcadores de estresse oxidativo como: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteína carbonilada, glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa-S-transferase (GST). Ainda em amostras do tumor ascítico de Ehrlich foram avaliados danos ao DNA, parada do ciclo celular, influência na captação de glicose e tipo de morte celular induzida pelos tratamentos. As mesmas amostras foram utilizadas para a análise de imunoeletroforese de proteínas envolvidas no dano ao DNA e proliferação celular (?H2AX e pAkt, respectivamente), na progressão do ciclo celular (p53, p16 e ciclina A), na captação de glicose (HIF-1a e GLUT1) e proteínas envolvidas na sinalização da morte celular (PARP, Bax, Bcl-xL). Resultados. As quinonas, quando associadas ao ascorbato, causaram um aumento na intercalação e clivagem oxidativa do CT-DNA. Em células MCF-7, a associação com ascorbato diminuiu significativamente a viabilidade celular. As associações juglona/ascorbato e, principalmente Q7/ascorbato, aumentaram os níveis de EROs intracelulares e os danos ao DNA. As três associações testadas causaram diminuição no número de colônias, porém, juglona/ascorbato e Q7/ascorbato foram capazes de inibir a proteína Akt fosforilada (pAkt). Os resultados in vitro foram reproduzidos in vivo. Juglona/ascorbato e Q7/ascorbato inibiram significativamente o desenvolvimento do tumor e aumentaram o tempo de sobrevida dos animais. Os marcadores de estresse oxidativo foram alterados, indicando uma indução na geração de EROs pelos tratamentos, aumentando assim a peroxidação lipídica e a carbonilação de proteínas, danificando o DNA das células do tumor ascítico de Ehrlich e promovendo também, a parada do ciclo celular em G1/S, redução da captação de glicose e morte celular por apoptose. Conclusão. Os resultados apresentados mostraram que o ascorbato de sódio potencializou o efeito antitumoral das quinonas juglona e, principalmente da Q7, também in vivo, evidenciando que estas associações são promissores agentes para o tratamento do câncer.<br> / Abstract : Introduction. Evidences point to the promising antitumor effect of quinones juglone, phenylaminonaphthoquinone-7 (Q7) and phenylaminonaphthoquinone-9 (Q9), especially when associated to ascorbate. Objective. To continue the studies on the antitumor effect of naphthoquinones juglone, Q7 and Q9 associated with sodium ascorbate, as well as to evaluate the best association for cancer treatment from the effects obtained in vivo and in vitro. Methodology. The effects of quinones juglone, Q7 and Q9 associated or not to sodium ascorbate on Calf Thymus-DNA were analyzed. Cell viability, levels of intracellular ROS, damages on DNA and cell proliferation were evaluated in MCF-7 cells (breast carcinoma). Proteins from MCF-7 cell lysate were used in immunoblotting assays to check the integrity of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), gamma-H2AX (?H2AX) and pAkt. The in vivo antitumor activity of quinones associated or not with sodium ascorbate was firstly analyzed by means of survival parameters and tumor growth of mice carrying Ehrlich ascitic tumor. After that, samples of the tumor were collected and analyzed for oxidative stress markers such as: thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), carbonylation of protein, reduced glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glutathione-S-transferase (GST). Also, of Ehrlich ascitic tumor, DNA damages, cellular cycle arrest, influence in glucose capture and type of cell death induced by the treatments were evaluated. The same samples were used in immunoblotting assays of proteins involved in damage to DNA and cell proliferation (?H2AX and pAkt, respectively), cell cycle progression (p53, p16 and cyclin A) and glucose capture (HIF-1a and GLUT1) and proteins involved in cell death signaling (PARP, Bax, Bcl-xL). Results. When associated to ascorbate, quinones promoted an increase in interleaving and oxidative cleavage of CT-DNA. In MCF-7 cells, the association with ascorbate declined significantly cell viability. The associations juglone/ascorbate and, mainly Q7/ascorbate increased levels of intracellular EROs and damage to DNA. The three assessed associations promoted the decrease in the number of colonies, however, julone/ascorbate and Q7/ascorbate were able to inhibit the protein pAkt. The in vitro results were in vivo reproduced. Juglone/ascorbate and Q7/ascorbate significantly inhibited the growth of the tumor and increased survival time of the animals. The oxidative stress markers were altered pointing to an induction in the generation of ROS by these treatments, thereby increasing lipid peroxidation and protein carbonylation, damaging DNA of cells of Ehrlich ascitic tumor also promoting, cellular cycle arrest in G1/S, reduction of glucose capture and cellular death by apoptosis. Conclusion. The results presented here showed that the sodium ascorbate potentialized the antitumor effect of juglone, especially Q7, also in vivo, evidencing that those associations are promising agents for cancer treatment.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-29T13:51:27Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação de Albert Rocha (versão final corrigida).pdf: 2822167 bytes, checksum: 2ad296bc0aaac078346eddd44a047b0f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-29T13:51:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação de Albert Rocha (versão final corrigida).pdf: 2822167 bytes, checksum: 2ad296bc0aaac078346eddd44a047b0f (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / CAPEs / Câncer é o nome dado a uma grande variedade de doenças que possuem como principal característica um crescimento celular contínuo e desordenado. A quimioterapia é uma das alternativas terapêuticas no combate ao câncer, entretanto as atuais opções terapêuticas são frequentemente acompanhadas de fortes efeitos colaterais. Inúmeros trabalhos vêm sendo desenvolvidos nos últimos anos, relacionando as moléculas tiazolidínicas com atividades antineoplásicas. No presente trabalho, foram realizadas a síntese e a caracterização estrutural de cinco derivados da série 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona, seguidas da avaliação da citotoxicidade de dois desses compostos sobre células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e sobre as linhagens de células neoplásicas DUO-145, HepG2, K562 e RAJI, utilizando ensaios de MTT. Inicialmente, realizou-se a síntese da tiazolidina-2,4-diona, a partir da reação entre ácido monocloroacético e tiouréia. Em seguida, realizaram-se N-alquilações, em uma solução equimolar de hidróxido de sódio, utilizando a tiazolidina-2,4-diona e diferentes haletos de benzila substituídos, obtendo-se intermediários 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona substituídos. Os compostos finais foram sintetizados a partir de reações de condensação na posição 5 do anel tiazolidínico, reagindo-se os intermediários, anteriormente sintetizados, com benzaldeídos, obtendo-se os compostos tiazolidínicos finais, com rendimentos entre 52 e 70%. A estrutura química dos compostos sintetizados foi determinada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H e de 13C, espectroscopia de infravermelho e por espectrometria de massas. A avaliação da seletividade citotóxica dos compostos 5-(3-cloro-benzilideno)-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-103) e 5 - (2,4-dimetóxi-benzilideno) - 3 - (2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-106) foi realizada sobre PBMC’s, através de ensaios MTT, apresentando resultados com viabilidade acima de 90%. Nos ensaios de citotoxicidade tumoral, a linhagem DUO-145 apresentou melhor suceptibilidade aos compostos testados, com valores de IC50 18,18 μM para o LPSF/GQ-103 e IC50 24,13 μM para o LPSF/GQ-106. / Cancer is the name given to a variety of diseases that have a major feature a continuous and disorderly cell growth. Chemotherapy is one of therapeutic alternatives to fight cancer, but the current therapeutic options are often accompanied by severe side effects. Numerous studies have been developed in recent years talking about the thiazolidine molecules with antineoplastic activities. In this study, we realized the synthesis and structural characterization of five derivatives of the series 5-benzylidene-3-benzyl-thiazolidine-2,4-dione, followed by evaluation of cytotoxicity of two such compounds on peripheral blood mononuclear cell (PBMCs) and on the tumor cell lines DUO-145, HepG2, K562 and RAJI, using MTT assays. Initially we realized the synthesis of thiazolidine-2,4-dione, from the reaction between monochloroacetic acid and thiourea. Then, it were realized N-alkylations using thiazolidine-2,4-dione and various substituted benzyl halides obtaining the intermediates 3-benzyl-thiazolidine-2,4-dione substituted. The final compounds were synthesized from condensation reaction in position 5 of the thiazolidine ring, by reacting intermediates previously synthesized with benzaldehydes obtaining tiazolidínicos final compounds in yields between 52 and 70%. The chemical structure of the synthesized compounds was determined by 1H and 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy, by infrared spectroscopy and by mass spectrometry. The evaluation of selective cytotoxicity of the compounds 5-(3-chloro-benzylidene)-3-(2-chloro-6-fluoro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione (LPSF/GQ-103) and 5-(2,4-dimethoxy-benzylidene)-3-(2-chloro-6-fluoro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione (LPSF/GQ-106) was performed on PBMC’s by MTT assay, presenting results viability above 90%. In the tumor cytotoxicity assays, the tumor cell line DUO-145 had better cytotoxic susceptibility to the tested compounds, with 18.18 μM IC50 value for the compound LPSF/GQ-103 and 24.13 μM IC50 value for the LPSF/GQ-106.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-05-22T18:55:44Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Parcial (Cap. 1-4) - Gleyce Jobim.pdf: 2210980 bytes, checksum: 9e8c7525474f1ea2b8e5a9f527b325cb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-05-22T18:56:02Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Parcial (Cap. 1-4) - Gleyce Jobim.pdf: 2210980 bytes, checksum: 9e8c7525474f1ea2b8e5a9f527b325cb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-22T18:56:02Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Parcial (Cap. 1-4) - Gleyce Jobim.pdf: 2210980 bytes, checksum: 9e8c7525474f1ea2b8e5a9f527b325cb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Unlike most other tumors, the incidence of malignant cutaneous melanoma has increased in the last 30 years. This is responsable for 75% of skin cancer deaths. Many molecular pathways involved in melanomogenesis have already been identified. However, there is still no chemotherapy protocol that guarantees long-term life expectancy. Nitrostyrene compounds are related to antitumor activities since 1975, however, there are no reports of this efficacy on melanoma. In vitro and in vivo antineoplastic effects of the synthetic nitrostyrene derivative 4-chloro-1-nitro-2-phenylethene (7E) were tested in several cell lineages, especially melanoma (SK-Mel-3 and B16F10). Cell viability was assessed by the Alamar Blue® test. Cell cycle, apoptosis, reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial depolarization were evaluated by flow cytometry. Caspases 9 and 3, JNK, p38, Bcl-2 and ERK expressions were determined by western blotting. We performed the murine melanoma model to verify the efficacy and toxicity in vivo. Our observations indicate that 7E is cytotoxic to several neoplastic lines, especially melanoma, IC50 of 3.13 μg/mL in SK-Mel-3 and 1.48 μg/mL in B16F10. We found out that 7E increased the level of intracellular reactive oxigen and nitrogen species (ROS/RNS). Furthermore, it increased expression of JNK, p38 and ERK, and reduced expression of Bcl-2. This leads to mitochondrial depolarization, possibly permeabilization of the outer membrane of the mitochondria and the release of cytotoxic proteins (DIABLO / Smac, AIF, ENDOG and CYTC), and the activation of caspase-9 and caspase-3, resulting in apoptotic cell death. The effects of 7E are antagonized by antioxidant pretreatment, confirming the unequivocal importance of increased ROS/RNS in this process. 7E also suppressed in vivo tumor growth by up to 47.8% under the tested conditions. The systemic toxic effect investigation revealed few significant alterations, highlighting the increase of serum urea biochemical dosage. There were no relevant changes in body mass, organ mass and haematological parameters. Tumor histology revealed necrosis and inflammation with microabcess areas, as well as invasion of adipose tissue with phagocytic reaction in animals treated with 7E. Animals treated with 7E had moderate hepatic alterations including necrosis, degeneration and congestion, renal alterations such as focal congestion, hemorrhage and glomerular sclerosis, reduction of the occurrence of pulmonary metastasis and maintenance of the architecture and normal cardiac morphology. Our findings suggest that 7E may have the potential to be further developed as an anticancer compound, especially for melanoma. / Diferente da maioria dos outros tumores, a incidência de melanoma cutâneo maligno vem aumentando nos últimos 30 anos. Esse subtipo de neoplasia é responsável por 75% das mortes por câncer de pele. Muitas vias moleculares envolvidas na melanomogênese já foram identificadas. No entanto, ainda não há um protocolo quimioterápico que garanta expectativa de vida a longo prazo. Compostos nitroestirenos são relacionados a atividades antitumorais desde 1975, no entanto, não há relatos dessa eficácia sobre o melanoma. A atividade antineoplásica in vitro e in vivo do derivado nitroestireno sintético 4-cloro-1-nitro-2-fenileteno (7E) foi testada em diversas linhagens celulares, com destaque para as de melanoma (SK-MEL-3 e B16F10). A viabilidade celular foi avaliada pelo teste de Alamar Blue®. Ciclo celular, apoptose, acúmulo de espécies reativas de oxigênio e despolarização mitocondrial foram avaliadas por citometria de fluxo. A expressão de caspases 9 e 3, JNK, p38, Bcl-2 e ERK foram determinadas por western blotting. E a eficácia e toxicidade in vivo foram verificadas em modelo de melanoma murino. Nossas observações experimentais indicam que o composto 7E é citotóxico sobre diversas linhagens neoplásicas, sobretudo as de melanoma, com CI50 de 3,13 μg/mL em SK-MEL-3 e 1,48 em B16F10. O composto induz ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs/ERNs), causando aumento da expressão de JNK, p38 e ERK e redução da expressão de Bcl-2. Isso leva à despolarização mitocondrial, provável permeabilização da membrana externa da mitocôndria e liberação de proteínas citotóxicas (DIABLO/Smac, AIF, ENDOG e CYTC), ativação de caspase-9 e caspase-3, resultando em morte celular por apoptose. Os efeitos de 7E são antagonizados pelo pré-tratamento com antioxidante, confirmando a inequívoca importância do acúmulo de EROs/ERNs nesse processo. 7E possui ainda efetiva ação in vivo promovendo inibição do crescimento tumoral de até 47,8% do volume nas condições testadas. A investigação do efeito tóxico sistêmico revelou poucas alterações significativas, destacando-se a elevação bioquímica da dosagem sérica de ureia. Não foram observadas alterações relevantes de massa corporal, massa dos órgãos e parâmetros hematológicos. A histologia do tumor revelou necrose e inflamação com áreas de microabcesso, além de invasão de tecido adiposo com reação fagocitária nos animais tratados com 7E. A histologia dos órgãos dos animais tratados com 7E revelou alterações hepáticas moderadas incluindo necrose, degeneração e congestão, alterações renais como congestão focal, hemorragia e esclerose glomerular, redução da ocorrência de metástase pulmonar e manutenção da arquitetura e morfologia cardíaca normal. Sendo assim, 7E tem potencial para ser desenvolvido como agente quimioterápico, sendo necessário mais estudos pré-clínicos e clínicos, que confirmarão sua utilidade na terapia antitumoral, sobretudo sobre o melanoma.

Plants have been used as sources of medicinal agents for millennia. Plant extracts and derived active principles have served as a major source for new pharmaceuticals for treatment of malignant tumors. In this work, we described the plants most used as anticancer agents, by the population treated on the Oncology Service of the University Hospital (Maceió-AL). The aim of this work was evaluate the toxicological effects of those plants and to value the antitumoral activity of the extracts and juices against human tumor cell lines and in neoplasic assays in vivo. Initially, the plants were collected, identified, and the hydroethanolic extracts and juices of Aloe vera and Euphorbia tirucalli were prepared. In the pharmacological approach, the follow assays were done: toxicity against brine shrimp Artemia salina, in vitro test against human tumor cell lines and in vivo evaluation using sarcoma 180 in mice. The plants were Annona muricata, Aloe vera, Schinus terebenthifolius, Hyptis pectinata, Stryphnodendron adstringens, Euphorbia tirucalli, Caesalpinia bonduc and Cnidosculus urens. The phytochemical screening showed the presence of flavonoids, tanins, saponins and sterols. The Artemia salina essay suggested moderate toxicity of the Stryphnodendron adstringens, Annona muricata e Euphorbia tirucalli. Hyptis pectinata was considered atoxic. In the preliminary in vitro assay only two species showed moderate cytotoxicity: Annona muricata (82%, 86% and 71% of inhibition) against SF295, HCT-8 and MDA-MB435 line cells, respectively and Hyptis pectinata (62% of inhibition) against HCT-8.line cells. Both plants presented no hemolytic effect and in the evaluation of the cytotoxicity activities against peripheral blood mononuclear cells, Annona muricata showed the biggest activity, although had shown bigger toxicity than Hyptis pectinata to PBMC. In the in vivo tests, Hyptis pectinata, Schinus terebinthifolius, Annona muricata and Euphorbia tirucalli inhibited the sarcoma 180 (70,5% - 67,1% - 58,9% and 57,5%). The histopathological analysis of the liver, kidneys and spleen of animals which was treated showed absence of lesions. Take together these results suggest that only two plants (Hyptis pectinata and Annona muricata) used by the population showed potential anti-tumor activity, at least in the used pharmacological models in vitro and in vivo. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / Plantas têm sido usadas como fonte de medicamentos há milênios. Extratos de plantas e princípios derivados ativos têm servido como a maior fonte de novos fármacos para tratamento de tumores malignos. Neste trabalho, descrevemos as plantas mais utilizadas como agentes anticancerígenos, pela população tratada no Centro de Oncologia do Hospital Universitário/UFAL (Maceió-AL). O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos toxicológicos destas plantas e analisar a ação de seus extratos e sucos sobre células tumorais em modelos in vitro e em neoplasias in vivo. Inicialmente, as plantas foram coletadas, identificadas, e os extratos hidroetanólicos e sucos de Aloe vera e Euphorbia tirucalli foram preparados. Na investigação farmacológica, os seguintes ensaios foram feitos: Toxicidade frente ao microcrustáceo Artemia salina, teste in vitro contra células de linhagem tumoral humana e avaliação in vivo utilizando Sarcoma 180 em camundongos. As plantas foram: Annona muricata, Aloe vera, Schinus terebenthifolius, Hyptis pectinata, Stryphnodendron adstringens, Euphorbia tirucalli, Caesalpinia bonduc e Cnidosculus urens. O screening fitoquímico mostrou a presença de flavonóides, taninos, saponinas e esteróides. O ensaio de Artemia salina sugeriu alta toxicidade de Stryphnodendron adstringens, Annona muricata e Euphorbia tirucalli; Hyptis pectinata foi considerada atóxica. No ensaio preliminar in vitro, apenas duas espécies exibiram moderada citoxicidade: Annona muricata (82%, 86% e 71% de inibição) contra as linhagens celulares SF295, HCT-8 e MDA-MB435, respectivamente e Hyptis pectinata (62% de inibição) contra a linhagem celular HCT-8. Ambas as plantas apresentaram nenhum efeito hemolítico e na avaliação da atividade citotóxica em células mononucleares do sangue periférico (PBMC), Annona muricata exibiu maior atividade, embora tenha apresentado maior toxicidade que Hyptis pectinata.para PBMC. Nos testes in vivo, Hyptis pectinata, Schinus terebinthifolius, Euphorbia tirucalli e Annona muricata e inibiram o Sarcoma 180 (70,5% - 67,1% - 58,9% e 57,5%). A análise histopatológica de fígado, rins e baço dos animais tratados, informou ausência de lesões. Em conjunto estes resultados sugerem que apenas duas plantas (Hyptis pectinata e Annona muricata) usadas pela população mostraram potencial atividade antitumoral, pelo menos nos modelos farmacológicos in vitro e in vivo utilizados.

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No. of bitstreams: 1 daniellecristinalimmermannfranco.pdf: 2469355 bytes, checksum: e65f0823e3d0c81a2ef45352354878ca (MD5) Previous issue date: 2017-05-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O resveratrol é um polifenol da classe dos estilbenos produzido por inúmeras plantas em resposta ao estresse do ambiente sendo reconhecido por apresentar inúmeras atividades biológicas, tais como antioxidante, anti-inflamatória, analgésica, antiviral, cardioprotetora, antitumoral, dentre muitas outras. Apesar disso, a reduzida biodisponibilidade do resveratrol tem sido fator limitante para a sua ampla utilização, fomentando a pesquisa por análogos quimicamente modificados que tenham suas atividades potencializadas e biodisponibilidade melhorada. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar os potenciais anti-inflamatório e antitumoral de compostos análogos do resveratrol. Foram avaliados quinze análogos quanto às suas propriedades físico-químicas e interferência na viabilidade de células RAW 264.7 e de células tumorais da linhagem 4T1 (método de MTT). Os oito análogos com melhor resposta aos ensaios anteriores foram selecionados e testados sobre outra linhagem celular (J774.A1) e cultura primária de macrófagos peritoneais, confirmando sua inocuidade às mesmas. A LC50 sobre células RAW 264.7 também foi determinada. Em seguida, os análogos foram testados quanto ao potencial antioxidante (ensaio de captura do íon DPPH); influência na produção de óxido nítrico (NO) (reação de Griess), de citocinas (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, IFN- e TNF-α) e da quimiocina CCL-2 (ambos por Elisa). A atividade imunomoduladora foi determinada por meio da análise da expressão de MHCII e de moléculas costimuladoras CD80, CD86 e CTLA-4 (citometria de fluxo), além da influência na proliferação de linfócitos T e B (método de MTT). A partir destes dados, quatro análogos foram selecionados e avaliados in vivo pelo modelo de edema de orelha murino, revelando resultados satisfatórios para todos os análogos. No entanto, dois deles se sobressaíram e foram empregados em um modelo de artrite induzida por zymosan, confirmando que os mesmos são capazes de fornecer resultados comparáveis à dexametasona. Quanto ao potencial antitumoral, foi determinado a LC50 e índice de seletividade (IS) dos análogos frente a linhagens celulares de câncer de mama humano (MCF-7) e murino (4T1) e melanoma murino (B16). Os resultados obtidos revelaram que pelo menos cinco análogos podem ser explorados neste sentido, apresentando IS comparávelou superior ao de fármacos classicamente utilizados na terapia antineoplásica. Mais estudos devem ser conduzidos no intuito de determinar os mecanismos de ação envolvidos na atividade anti-inflamatória, a influência da imunomodulação na atividade antitumoral e a biodisponibilidade destes análogos. / Resveratrol is a polyphenolic phytoalexin stilbene produced by many plants in response to hostile environmental conditions, recognized to present innumerous biological activities, such as antioxidant, anti-inflammatory, analgesic, antiviral, cardioprotective, antitumor and others. However, the reduced bioavailability of resveratrol has been the limiting factor for its widespread use. Therefore, chemically modified resveratrol analogs that have its activities potentiated, eliminating the problem of bioavailability, are the subject of investigations. Thus, the aim of the present study was to evaluate the anti-inflammatory and antitumor potential of resveratrol analogues. Fifteen analogues were evaluated for physicochemical properties and influence on the viability of RAW 264.7 cells and 4T1 strain tumor cells (MTT method), determining the analogs with highest potential to remain in the study. Thus, the eight selected analogs were tested on another cell line (J774.A1) and a primary culture (peritoneal macrophages), confirming their innocuity to it. These analogs also had LC50 determined on RAW 264.7 cells. Next, it was tested for antioxidant potential (DPPH ion capture assay); evaluated on the influence on the production of nitric oxide (NO) (Griess reaction for nitrite dosing); cytokines (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, IFN- and TNF-α) and chemokine (MCP1) (both by Elisa); Expression of MHCII and CD80, CD86 and CTLA-4 (flow cytometry) and proliferation of T and B lymphocytes (MTT method). From these data, four analogs used topically in a model of acute inflammation of ear edema were found, revealing satisfactory results for all analogues. However, two of them excelled and were employed in a Zymosan-induced arthritis model, confirming that they are able to provide results comparable to dexamethasone. As for the direct antitumor potential of synthetic molecules, the LC50 and the selectivity index (SI) against human breast cancer cells (MCF-7) and murine (4T1) and murine melanoma (B16) were determined. The obtained results revealed that at least five analogs can be exploited in this way, presenting comparable or higher SI than drugs classically used in antineoplastic therapy. Further studies shall be conduct in order to determine the mechanisms of action involved in anti-inflammatory activity, the influence of immunomodulation on antitumor activity and the bioavailability of these analogs.