Células germinativas embrionárias são células pluripotentes derivadas das células germinativas primordiais que surgem no período do desenvolvimento embrionário. Sendo precursoras na maturação dos gametas sendo para a proliferação e formação de novas gerações de células germinativas. Estudos em modelos animais com células troncos embrionárias pluripotentes têm sido realizados com sucesso no tratamento de muitas doenças genéticas, principalmente em modelos caninos devido a homologia com humanos. Portanto, objetivamos estabelecer um estudo da biologia das células erminativas caninas para futuras pesquisas, visando sua viabilidade terapêutica. Foram utilizadas fêmeas de cães sem raça definida (SRD), foram submetidas à ovario-salpinge-histerectomia, oriundas de campanhas de castração realizadas por associações e/ou organizações não governamentais na cidade de Pirassununga. Os embriões coletados foram analisados através de um cronograma histológico e também mensurados através da medida Crown-Rump(CR), em seguida em condições ésteres micro-dissecados na região paramesonéfrica próximo a região dos somitos. Os fragmentos foram isolados e colocados em cultivo com meio apropriado para o desenvolvimento e propagação das células germinativas primordiais (PGCs). Obteve-se sucesso nos cultivos com embriões em idades gestacionais próximas a 24 á 32 dias de gestação, nos quais demonstraram uma morfologia arredondada, pequena. Na microscopia eletrônica de varredura e transmissão observamos tamanhos variados entre as células aderidas umas as outras, mostrando um núcleo bem evidente e em seu citoplasma observou-se diversos tipos de organelas celulares, principalmente mitocôndrias. A análise imunohistoquímica revelou a presença de marcadores Oct4, sugerindo a presença de células pluripotentes e germinativas. Imunofenotípicamente as células através da citometria de fluxo revelou baixa expressão para o marcadore Oct4 enquanto que para os marcadores CD 34, C-Kit houve expressão.RT-PCR mostrou expressão do marcador para pluripotencialidade Oct4 e Sox2 e pela técnica de Western Blotting identificou a expressão da proteína específica para Oct4. Portanto estes achados sugerem com sucesso o estabelecimento de cultivo e proliferação e desenvolvimento das células germinativas primordiais caninas. / Embryonic germ cells are pluripotent cells derived from primordial germ cells which arise during embryonic development. These cells are precursors in the maturation of gametes and for proliferation and formation of new generations of germ cells. Studies using animal models for pluripotent embryonic stem cells have been conducted successfully in the treatment of many genetic diseases, especially using canine models, due the homology between canine and humans. Therefore, we aimed to establish a study of canine biology of germ cells for future research, aiming viability therapy. For this study, we used female mongrel dogs (SRD), which underwent ovary- salpingo- hysterectomy, arising from castration campaigns run by associations and/or NGOs in Pirassununga city. The embryos collected were analyzed using histology methods following the timeline and measure by measuring Crown-Rump (CR) then in an environment without contaminants (sterile) the embryos were micro-dissected focusing in the paramesonephric region near the region of somite where the germ cells are. The fragments were isolated and placed in culture with a specific media for the development and spread of primordial germ cells (PGCs). Success was achieved in cultures with embryos at a gestational age close to 22 to 30th days of gestation, in which the cells showed a rounded morphology and small. In electron microscopy and transmission analyses, sizes were observed between the cells attached to each other, showing a conspicuous nucleus and in the cytoplasm was observed several types of cell organelles, especially mitochondria. Immunohistochemical analysis revealed the positive immunolabeling for Oct4, suggesting the presence of pluripotent cells and germ cells. The analyses using immunophenotyping by flow cytometry showed low expression for Oct4 while for CD34 and C-kit markers had positive expression. RT-PCR showed expression of the pluripotency markers Oct4 and Sox2. By the technique of Western Blotting identified protein expression specific for Oct4. Thus these findings suggest the successful establishment of culture, proliferation and development of primordial germ cells canine.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-14112013-150423 |
| Date | 25 January 2013 |
| Creators | Aline Fernanda de Souza |
| Contributors | Daniele dos Santos Martins, Felipe Perecin, George Shigueki Yasui |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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