Doctor en Bioquímica / El retículo endoplásmico (RE) y la mitocondria son organelos celulares que
entablan una continua y dinámica conversación que permite a la célula
responder coordinadamente a diversas situaciones fisiopatológicas. Datos
previos de nuestro Laboratorio mostraron que ambos organelos incrementan los
puntos de contacto físico durante la fase temprana del estrés de RE,
permitiendo una mayor transferencia de Ca2+ desde el RE hacia la mitocondria y
estimulando así el metabolismo de este último organelo y favoreciendo la
sobrevida celular. El presente proyecto estudió la participación de proteína
quinasa A (PKA) y caveolina-1 (Cav1) como agentes reguladores de esta
interacción física y funcional entre el RE y la mitocondria. Como modelo de
estudio se utilizaron células HeLa tratadas con tunicamicina como agente
inductor de estrés de RE por 4 h.
Primero, se investigó la participación de PKA en la fase temprana del
estrés de RE. Esta quinasa se activó ante condiciones de estrés, medido por la
fosforilación de DRP1 en Ser637 por Western blot y concomitante elongación
mitocondrial (microscopía confocal). El inhibidor específico de PKA H89 previno
estos cambios, comprobando que ambos son dependientes de PKA.
Posteriormente, se estudió la participación de PKA en el acoplamiento
RE-mitocondria a través de la medición de proximidad (microscopía confocal),
contactos físicos (microscopía electrónica), transferencia de Ca2+ (microscopía de fluorescencia) y bioenergética mitocondrial (tasa de consumo de oxígeno). El
papel de PKA en estos procesos se evaluó por modulación farmacológica con
H89. Los resultados mostraron que la activación de PKA es necesaria para
inducir la formación de contactos RE-mitocondria, y de esta forma, gatillar la
respuesta adaptativa frente a estrés de RE.
Luego se investigó el papel de Cav1 sobre la interface RE-mitocondria. La
expresión de Cav1 abolió completamente la respuesta adaptativa frente a estrés
de RE temprano, evidenciado mediante proximidad entre organelos,
transferencia de Ca2+ y respiración mitocondrial. Además de alterar esta
plasticidad organelar frente a condiciones de estrés, la expresión de Cav1
disminuyó significativamente la bioenergética mitocondrial basal, junto con
inducir un remodelado basal de la interface RE-mitocondria medido por
purificación de las membranas del RE asociadas a mitocondria (MAM).
Finalmente, se determinó que la expresión de Cav1 antagonizó la
señalización de PKA, impidiendo que ella fosforile a DRP1 y promueva la
elongación mitocondrial en respuesta a estrés de RE. Más aún, mediante
fraccionamiento subcelular, se estableció que Cav1 afectó la localización
subcelular de PKA, evitando que se relocalice a las membranas microsomales
en respuesta al estrés de RE. De este modo, Cav1 actúa como un regulador
negativo de PKA, previniendo su activación frente a estrés de RE, evitando así
la respuesta adaptativa celular / The endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria are two organelles that
continuously communicate between one another. This organelle crosstalk allows
mitochondria and ER to coordinate responses to a variety of physiological and
pathophysiological situations. Data from a previous work show that during the
early phase of ER stress, both organelles increase their contact sites,
augmenting thereby calcium transfer from ER to mitochondria. This response
boosts mitochondrial bioenergetics and ultimately promotes cell survival. Here,
we sought to study the role of Protein Kinase A (PKA) and Caveolin-1 (Cav1) as
regulators of such organelle crosstalk. As an experimental model, HeLa cells
were treated with tunicamycin to induce ER stress.
First, we observed that PKA was activated during early stages of ER
stress, as assessed by increased phosphorylation of DRP1 at the inhibitory site
Ser637 (Western blot), and that this event was followed by mitochondrial
elongation (confocal microscopy). The specific PKA inhibitor H89 prevented
these changes, thus confirming that they were due to PKA and not another
kinase.
Subsequently, we studied ER-mitochondria coupling by evaluating
organelle proximity (confocal microscopy), physical contact sites (electron
microscopy), Ca2+ transfer (fluorescence microscopy) and mitochondrial
bioenergetics (oxygen consumption rate). PKA was again involved in these processes by pharmacological modulation using the inhibitor H89. Our results
show that PKA activation is necessary to induce the formation of ERmitochondria
contacts and to trigger the adaptive metabolic responses to ER
stress.
Next, we investigated the role of Cav1 as a modulator of the
ER-mitochondria interface. Cav1 overexpression completely abolished the early
adaptive response to ER stress, as assessed by evaluating the proximity
between organelles, calcium transfer and mitochondrial respiration. In addition to
altering organelle plasticity in response to stress conditions, Cav1
overexpression severely decreased baseline mitochondrial bioenergetics and
induced basal remodelling of the ER-mitochondria interface, as determined by
purification and analysis of mitochondria-associated ER membranes.
Finally, we determined that Cav1 overexpression antagonizes PKA
signalling, preventing PKA-dependent DRP1 phosphorylation and mitochondrial
elongation in response to ER stress. Moreover, subcellular fractionation
revealed that Cav1 affected PKA localization, prevented redistribution to
microsomal membranes in response to ER stress, and altered the pattern of
DRP1 phosphorylation. Thus, Cav1 functions as a negative regulator of PKA
that precludes PKA activation during early ER stress and thereby prevents the
adaptive cellular response / Fondecyt; Fondap;
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/136838 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Bravo Sagua, Roberto |
| Contributors | Quest, Andrew F. G., Lavandero González, Sergio, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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