Orientador: Iscia Teresinha Lopes-Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T13:10:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Torres_FabioRossi_D.pdf: 9761976 bytes, checksum: 5bf6571c4665ed95a3d8ae8ccbb18717 (MD5)
Previous issue date: 2008 / Resumo: A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) e os distúrbios do desenvolvimento cortical (DDC) são duas das mais importantes causas de epilepsia. Avanços nos estudos de genética molecular levaram a descoberta de genes responsáveis por vários DDCs como a heterotopia nodular periventricular (HNP), o espectro da lissencefalia-heterotopia subcortical em banda (LIS-HSB), a esquizencefalia, a polimicrogiria e para um subtipo de ELT, a epilepsia autossômica dominante com auras auditivas (EADAA). Os principais objetivos deste projeto foram: 1) realizar uma triagem de mutações nos quatro principais genes associados aos DDC (FLN1, LIS1, DCX e EMX2) em um grande grupo de pacientes com este tipo de malformação, 2) mapear os loci para a EADAA, 3) investigar o mecanismo molecular das mutações identificadas. A triagem de mutações foi realizada através da técnica de denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) e subseqüente sequenciamento automático dos fragmentos alterados. Para estudo funcional das mutações identificadas foi utilizada a técnica de HUMARA e PCR em tempo real. A análise de ligação foi realizada através da amplificação por PCR de marcadores microsatélites marcados com fluoróforos e análise dos alelos com os programas Fragment Profiler® e MLINK®. Um total de 108 pacientes com diferentes formas de DDC foi estudado, 13 pacientes possuem HNP, 19 são portadores do espectro LIS-HSB, 46 possuem esquizencefalia, enquanto 30 são afetados por polimicrogiria perisilviana bilateral. Nosso grupo também identificou quatro famílias segregando EADAA, sendo que duas possuem poder estatístico significativo para estudos de análise de ligação. Uma mutação deletéria G987C que altera o sítio de splicing do sexto intron do gene FLN1 foi identificada em dois indivíduos relacionados, portadores da forma clássica e bilateral de HNP. Diferença no padrão de inativação do cromossomo X foi detectada como o provável fenômeno responsável pelas diferenças clínicas entre os dois pacientes. No grupo de pacientes com o espectro LIS-HSB, foi identificada uma mutação deletéria A1385C que altera uma histidina por uma prolina no aminoácido 277 da proteína LIS. Apenas alterações neutras foram identificadas no gene DCX. No grupo de indivíduos com esquizencefalia e polimicrogiria foram encontradas apenas variações neutras no gene EMX2. A análise de ligação foi positiva para um locus no cromossomo 10 apenas para uma família com EADAA. O sequenciamento automático de indivíduos afetados identificou uma mutação no gene LGI1 (IVS7-2A>G), além do mais, estudos de neuroimagem identificaram malformações corticais em pacientes com mutações em LGI1. Análise genética e de mutações na família de genes LGI e em MASS1 identificou apenas variantes neutras nestes genes para as demais famílias estudadas. A análise de ligação genômica randômica em uma família com EADAA informativa e sem mutações em LGI1 identificou uma região candidata a possuir um gene implicado com esta síndrome no cromossomo 6q22 que, no entanto não foi confirmado pela análise subseqüente de marcadores adicionais na região candidata. Através deste trabalho podemos concluir que: a) Mosaicismo, mutações em regiões não codificantes, grandes deleções e rearranjos, além da presença de casos atípicos, são fatores que podem estar influenciando na baixa freqüência de mutações encontradas em pacientes com HNP e o espectro LIS-HSB, b) mutação no gene FLN1 foi encontrada em casos familiares de HNP bilateral, c) o mecanismo patológico desta mutação é uma destruição do sito de splicing do sexto intron do gene FLN1, d) as diferenças fenotípicas entre os dois pacientes portando esta mutação podem ser explicadas por diferenças no padrão de inativação do cromossomo X, e) mutações de sentido trocado no gene LIS1 são raras em pacientes com LIS-HSB e a localização das mesmas em domínios terminais WD não estão relacionados a fenótipos menos severos, f) a esquizencefalia e a polimicrogiria não têm base genética relacionada com o gene EMX2, g) a EADAA é uma entidade geneticamente heterogênea, já que mutações em LGI1 foram identificadas em apenas uma família com esta síndrome, h) malformações corticais em pacientes com EADAA e mutações em LGI1 foram descritas pela primeira vez, i) os genes pertencentes à família LGI e MASS1, não estão envolvidos com a etiologia da EADAA nas demais famílias analisadas, j) um locus candidato para o segundo gene responsável pela EADAA foi identificado no cromossomo 6q22, no entanto a saturação da região com marcadores adicionais não confirmou este achado / Abstract: Temporal Lobe Epilepsy (TLE) and malformations of cortical development (MCD) are two of the most important causes of epilepsy. Extensive molecular genetic studies have resulted in gene discovery for MCD such as periventricular nodular heterotopia (PNH), lisencephaly/ subcortical band heterotopia spectrum (LIS-SBH), schizencephaly, polymicrogyria and for a subtype of TLE, the autossomic dominant partial epilepsy with auditory features (ADPEAF). The main goals of this project were 1) to screen for mutations in the four main genes responsible for abnormal cortical development (FLN1, LIS1, DCX and EMX2) in a large cohort of patients with different types of cortical malformations 2) to map the loci for ADPEAF and 3) to investigate molecular mechanisms of mutations identified. Mutation screening was performed by the polymerase chain reactions (PCR). PCR products were analyzed by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) and were subsequently sequenced using standard automatic sequencer. In addition, HUMARA marker and Real Time PCR were performed to study molecular mechanisms resulting from the mutations identified. Linkage analysis was carried out by amplifying microsatellites markers by PCR and analyzing alleles with Fragment profiler® software and MLINK® package program. We have studied a total of 108 patients with MCD. Thirteen had PNH, 19 had the LIS-SBH spectrum, 46 individuals had schizencephaly and 30 had polymicrogyria. In addition we have identified four families segregating ADPEAF. Two families were considered informative for linkage analysis. We found a G987C mutation that alters the splicing site of the 6th intron of the FLN1 gene in two related patients with classical PNH findings, skewed X chromosome inactivation was detected as the possible mechanism responsible for clinical differences between the two patients. In the LIS-SBH group, one patient with agyria/pachygyria had an A1385C transversion, which changes a histidine for a proline in amino acid 277 of the LIS1 protein. Furthermore, in the group of the schizencephalies and polymicrogyria we have detected only neutral variants in the EMX2 gene. Linkage analysis in ADPEAF showed linkage to chromosome 10q in only one family. Automatic sequencing identified a mutation in the LGI1 gene. In addition, neuroimaging studies showed cortical malformations in patients with LGI1 mutations. Mutation and genetics analysis of the LGI gene family and MASS1 in other pedigrees failed to show a role for these genes in the etiology of ADPEAF. A genome wide scan performed in a large family segregating ADPEAF point to a potential candidate region on chromosome 6q22, which was not confirmed after further investigation with additional microsatellite markers. We conclude that: a) Mosaicism, mutations in non coding regions, large deletions and the presence of atypical cases could have contributed for the low frequency of mutations found in patients with PNH and the LIS-SBH spectrum b) we found mutations in the FLN1 gene in familial cases of bilateral PNH, c) the pathologic mechanism of this mutation is the splicing site destruction of the 6th FLN1 gene intron, d) phenotypic differences between the two related patients harboring this FLN1 mutation were explained by a non random X chromosome inactivation, e) missense mutations in the LIS1 gene are a rare finding in patients with the LIS-SBH spectrum and its localization in latter WD domains are not always related with less severe LIS, f) schizencephaly and polymicrogyria appear not to have a genetic background in the EMX2, since our study detected only a neutral polymorphism in these patients, g) ADPEAF is a genetically heterogeneous entity, since mutations in the LGI1 gene were identified only in one family with this syndrome, h) cortical malformation in the left temporal lobe was detected by the first time in individuals with ADPEAF and LGI1 mutations, i) MASS1 and LGI gene family were not involved with ADPEAF etiology in the other pedigrees studied, j) a potential candidate locus to contain the second gene responsible for ADPEAF was identified in chromosome 6q22, however additional studies failed to confirm linkage in this region / Doutorado / Neurociencias / Doutor em Fisiopatologia Medica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/309741 |
| Date | 31 January 2008 |
| Creators | Torres, Fabio Rossi |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Lopes-Cendes, Íscia Teresinha, 1964-, Smith, Marilia de Arruda Cardoso, Bustamante, Vera Cristina Terra, Melo, Mônica Barbosa de, Guerreiro, Carlos Alberto Mantovani |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 261p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0028 seconds