Die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wird durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren verursacht, darunter gewisse Umwelteinflüsse, genetische Veranlagungen oder Virusinfektionen. So vielfältig die Ursprünge von Autoimmunerkrankungen sind, so divers sind die daraus resultierenden Erkrankungen, wodurch die Entwicklung zuverlässiger Therapien erschwert wird. Obwohl verschiedene Behandlungsmöglichkeiten existieren, welche die Symptome bei Autoimmunerkrankungen wie neuroinflammatorischer Multipler Sklerose (MS) mildern können, z.B. mit monoklonalen Antikörpern (mAk), wirken die meisten Medikamente breit und unspezifisch. Dies beeinträchtigt die Funktionalität des Immunsystems, was wiederum zu einem höheren Risiko für bakterielle und virale Infektionen, maligne Erkrankungen oder sekundäre Autoimmunität führen kann. Andere Therapieansätze untersuchen daher Möglichkeiten einer Antigen-abhängigen Immuntoleranz-Induktion. Allerdings befinden sich diese noch in den frühen Entwicklungsphasen und deren klinische Wirksamkeit muss noch bewiesen werden. Alternativ hat es sich in der onkologischen Immuntherapie als erfolgreich erwiesen, entweder natürliche oder gentechnisch veränderte Immunzellen zu aktivieren. Bisher wurden humane T-Zellen, welche mit Hilfe chimärer Antigenrezeptoren (CAR) mit ausgewählter Spezifität ausgestattet sind, sehr erfolgreich in der Klinik gegen Tumorerkrankungen genutzt. Basierend auf diesen klinischen Erfolgen stellt sich die Frage, ob CAR T-Zellen auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden können. Herkömmlichen CAR T-Zellen mangelt es jedoch sowohl an Flexibilität als auch an Kontrollierbarkeit, da sie mit einem CAR gegen ein einzelnes Antigen ausgestattet sind und in Gegenwart des Zielantigens dauerhaft aktiviert und nicht kontrollierbar sind. Um Limitationen konventioneller CARs zu überwinden, wurden universelle Adapter-CARs (UniCARs, RevCARs) in der Gruppe von Prof. Bachmann entwickelt. Die modulare UniCAR-Plattform besteht aus universell einsetzbaren UniCAR T-Zellen und anpassbaren antigenspezifischen Zielmodulen (TMs). Die Bindungseinheit des UniCAR basiert auf einem mAk mit Spezifität gegen ein Peptidepitop, das Teil des TMs ist und welches spezifisch an Zielantigene auf Tumorzellen bindet. Das TM fungiert als Adaptermolekül, das eine Vernetzung der UniCAR T-Zelle mit der Zielzelle herstellt. Nach der Vernetzung mit der Zielzelle über das TM wird die UniCAR T-Zelle aktiviert, so dass die Zielzelle eliminiert wird. Eine vor Kurzem vorgenommene Modifikation der extrazellulären UniCAR-Domäne führte zu der Reverse CAR (RevCAR)-Plattform, welche die Spezifität und Sicherheit noch weiter erhöhen sowie tonische Signale konventioneller CARs reduzieren soll. Dabei wurde die extrazelluläre mAk-basierte UniCAR-Domäne mit dem Peptidepitop des TM ausgetauscht. Eines der am besten untersuchten Autoantigene bei neuroinflammatorischen Erkrankungen ist das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). Dieses Protein befindet sich ausschließlich im zentralen Nervensystem an der abaxonalen Membran der nervenschützenden Myelinscheide. Obwohl neuroinflammatorische Erkrankungen wie MS hauptsächlich durch T-Zellen verursacht werden, wurden bei MS-Patienten auch Autoantikörper gegen MOG nachgewiesen, was auf die Beteiligung autoreaktiver B-Zellen an der Verschlimmerung der Krankheit hinweist. Diese Ergebnisse werden durch die wirksame Behandlung von MS-Patienten mit anti-CD20-mAks belegt. In dieser Arbeit wurde MOG als erstes Modell-Zielantigen für das Retargeting von CAR-modifizierten T-Zellen gegen anti-MOG-Ak-exprimierende humane Zellen verwendet. Ziel dieser Arbeit war neue TMs basierend auf der extrazellulären Domäne des MOG Antigens zu entwickeln, die dazu dienen, UniCAR oder RevCAR T-Zellen zur Eliminierung von anti-MOG Ak-exprimierenden Zielzellen zu aktivieren. Zur Bestimmung des optimalen MOG-Antigen TM-Formats wurden für die UniCAR-Plattform ein monovalentes (25 kDa) und ein bivalentes MOG-Antigen TM (50 kDa) entwickelt. Die Wirksamkeit des UniCAR-Systems wurde in vitro demonstriert. Es konnte dabei gezeigt werden, dass beide TMs bereits nach einer kurzen Inkubationszeit von 8 Stunden eine TM-spezifische Lyse Anti-MOG scFv-exprimierender menschlicher Zelllinien durch UniCAR-T-Zellen vermitteln. Darüber hinaus war es möglich, das zytotoxische Potential der UniCAR-T-Zellen durch die Dosierung der TMs zu kontrollieren. Um zu überprüfen, ob der Effekt basierend auf der UniCAR-Platform gegen anti-MOG scFv-exprimierende Zielzellen noch gesteigert werden kann, wurde ein monovalentes MOG-Antigen RevTM für die RevCAR-Plattform entwickelt. In Kombination mit RevCAR-T-Zellen übertraf die Anwendung des RevTM beide UniCAR TMs hinsichtlich Bindungsaffinität und dosisabhängiger Zytotoxizität gegen zwei anti-MOG scFv-exprimierende Zelllinien in vitro. Außerdem war die Freisetzung proinflammatorischer und T-Zellwachstum-fördernder Zytokine im Vergleich zu UniCAR T-Zellen höher und ausgeprägter. Weiterhin wurde die Funktionalität des RevCAR-Systems gegen anti-MOG-scFv-exprimierende Zielzellen in vivo bewiesen. Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass die modularen Adapter-CAR T-Zell-Plattformen neben der Krebsimmuntherapie auch bemerkenswertes Potential für die Behandlung von MOG-assoziierten Autoimmunerkrankungen hat. Damit konnte ein erster Grundstein dafür gelegt werden, CAR T-Zellen auf die Anwendung in Autoimmunerkrankungen zu übertragen, um zukünftig gezielt fehlerhafte Immunzellen zu beseitigen, die nachweislich zur Verschlimmerung von Autoimmunerkrankungen beitragen.:Table of contents I
List of abbreviations VI
1 Introduction 1
1.1 The human immune system 2
1.2 B cells and antibodies 3
1.2.1 Antibody structure 3
1.2.2 Tolerance induction 4
1.2.3 B cell activation 5
1.2.4 B cell functions in autoimmune diseases 6
1.3 Multiple sclerosis – an example for neuroinflammatory demyelination diseases 8
1.3.1.1 Disease phenotypes 9
1.3.1.2 Immunopathogenesis 9
1.3.2 Autoantigen myelin oligodendrocyte glycoprotein 11
1.4 Immunotherapy 14
1.4.1 Monoclonal antibody therapy 14
1.4.2 Chimeric antigen receptor therapy 16
1.4.2.1 UniCAR and RevCAR T cell system 18
1.4.2.2 CAR T cells in autoimmune diseases 22
1.5 Objectives 23
2 Materials and Methods 25
2.1 Materials 25
2.1.1 Consumables 25
2.1.2 Devices and software 27
2.1.3 Chemicals and reagents 32
2.1.4 Buffers and solutions 36
2.1.5 Enzymes and enzyme buffers 38
2.1.6 Kit systems 39
2.1.7 Plasmid vectors 39
2.1.8 Oligonucleotides 41
2.1.9 Antibodies 41
2.1.10 Basic media, additives, and recombinant proteins 43
2.1.11 Composition of culture media 44
2.1.12 Bacterial strain 46
2.1.13 Cell lines 46
2.1.14 Mouse strain 47
2.2 Methods 47
2.2.1 Molecular biological and microbiology methods 47
2.2.1.1 DNA digestion with restriction enzymes 47
2.2.1.2 Dephosphorylation of vectors 48
2.2.1.3 Agarose gel electrophoresis 48
2.2.1.4 Isolation and purification of DNA fragments from agarose gels 48
2.2.1.5 Ligation of DNA fragments 49
2.2.1.6 Heat-shock transformation of competent E. colis 49
2.2.1.7 Plasmid mini preparation 49
2.2.1.8 Plasmid midi preparation 50
2.2.1.9 Determination of DNA concentration 50
2.2.1.10 DNA sequencing 50
2.2.2 Cell biology methods 50
2.2.2.1 Cultivation of eukaryotic cells 50
2.2.2.2 Freezing and thawing cultured cells 51
2.2.2.3 Determination of cell number 52
2.2.2.4 Lentiviral transduction of eukaryotic cells 52
2.2.2.5 Immunofluorescence labeling 54
2.2.2.6 Flow cytometry and analysis of flow cytometry data 55
2.2.2.7 Isolation of human peripheral blood mononuclear cells 57
2.2.2.8 Isolation of T cells from PBMCs with magnetic-activated cell sorting 58
2.2.2.9 Stimulation of isolated human T cells 58
2.2.2.10 Engraftment of T cells with chimeric antigen receptors 59
2.2.3 Methods of protein biochemistry 59
2.2.3.1 Isolation of target module constructs 59
2.2.3.2 Dialysis of purified target module constructs 60
2.2.3.3 Discontinuous Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 60
2.2.3.4 Determination of concentration and immunochemical detection of target module constructs 62
2.2.3.5 Determination of binding affinities of target modules using enzyme-linked immunosorbent assay 63
2.2.4 In vitro functional studies 64
2.2.4.1 T cell activation and exhaustion assay 65
2.2.4.2 Luciferase assay (cytotoxicity assay) 65
2.2.4.3 Determination of cytokine concentration 65
2.2.5 In vivo functionality studies 66
2.2.5.1 Evaluation of tumor killing in vivo 66
2.2.5.2 Optical imaging of luciferase-expressing tumors in vivo 67
2.2.6 Statistical evaluation 67
3 Results 68
3.1 Design and generation of novel MOG target modules 68
3.1.1 MOG target module constructs 68
3.1.2 Expression of target modules 69
3.2 Establishment of scFv MOG-presenting cell models 72
3.3 Binding properties of MOG target modules 74
3.3.1 Determination of binding affinity between anti-MOG antibody and MOG target modules with enzyme-linked immunosorbent assay 74
3.3.2 Determination of binding affinity between anti-MOG receptor-expressing cell lines and MOG target modules with flow cytometry 75
3.4 Generation of human CAR-expressing T cells and binding of MOG target modules 80
3.4.1.1 Genetic modification of human T cells for UniCAR expression 81
3.4.1.2 Genetic modification of human T cells for RevCAR expression 83
3.5 Redirection of UniCAR T cells in vitro 85
3.5.1 Activation of redirected UniCAR T cells 85
3.5.2 Cytokine profile of redirected UniCAR T cells 87
3.5.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89
3.5.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89
3.5.3.2 Efficacy of UniCAR target modules 91
3.6 Redirection of RevCAR T cells in vitro 92
3.6.1 Activation of redirected RevCAR T cells 92
3.6.2 Cytokine profile of redirected RevCAR T cells 95
3.6.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by RevCAR T cells 99
3.6.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells using RevCAR T cells 99
3.6.3.2 Efficacy of RevCAR target module 101
3.7 Investigation of RevCAR T cell-mediated cytotoxicity in vivo 103
4 Discussion 105
4.1 Structure and purification of MOG target modules 106
4.2 Expression and purification of target modules 107
4.3 Binding properties of MOG target modules 107
4.4 In vitro cytotoxic potential of UniCAR and RevCAR T cells redirected by MOG target modules 110
4.4.1 Target module-specific redirection of UniCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 110
4.4.2 Target module-specific redirection of RevCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 112
4.5 Future prospective 116
5 Summary 119
6 Zusammenfassung 121
7 References 124
List of figures 145
List of tables 147
Acknowledgement 148
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:83176 |
| Date | 31 January 2023 |
| Creators | Lamprecht, Chris |
| Contributors | Ziemssen, Tjalf, Schmitz, Marc, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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