Au cours des processus de croissance folliculaire et d'ovulation, les cellules stéroïdogéniques, y compris les cellules de granulosa (CG), jouent un rôle crucial dans la maturation et la libération de l'ovocyte. Notre laboratoire a identifié et caractérisé pour la première fois tribbles pseudokinase 2 (TRIB2) dans les CG de follicules ovariens. Des études ont démontré que TRIB2 joue un rôle dans la coordination de la mitose et la morphogenèse chez la drosophile alors que chez la souris, son expression dans les cellules du cumulus serait liée à la maturation ovocytaire. Cependant, le rôle exact de TRIB2 dans la fonction des CG et ses effets sur les voies de signalisation impliquées dans la croissance folliculaire restait à être défini. La présente étude de doctorat avait donc pour but d’étudier la fonction et les partenaires de liaison de TRIB2 dans les CG de follicules ovariens bovins. À l’aide d’un modèle d’étude in vivo consistant en des CG obtenues à partir de follicules à différents stades de développement, nous avons démontré une régulation à la baisse de TRIB2 par l’hormone lutéinisante (LH) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) aussi bien au niveau du messager que de la protéine. De plus, les analyses utilisant un modèle in vitro de CG en culture ont montré que la FSH stimule l'expression de TRIB2 tandis que l'inhibition de TRIB2 via CRISPR/Cas9 entraîne une réduction significative de la prolifération des CG (P<0,05). Les analyses Western blot ont montré une augmentation des niveaux de phosphorylation d’ERK1/2 (MAPK3/1) et p38MAPK (MAPK14) suite à la surexpression de TRIB2. Ces résultats suggèrent un rôle de TRIB2 dans la croissance folliculaire et la modulation des voies MAPK. Avec l’approche double hybride chez la levure, nous avons identifié CALM1, INHBA, INPPL1, NT5E, SCD, SDHB et RAB14 comme partenaires de liaison de TRIB2. Les analyses RT-PCR ont montré que ces partenaires sont régulés différemment au cours du développement folliculaire et les manipulations de l’expression de TRIB2 (inhibition ou surexpression) résulte en une régulation différente (augmentation ou diminution) de l’expression des partenaires dans les CG. Ces résultats suggèrent un rôle de TRIB2 dans la régulation de cibles effectrices en lien avec la fonction des CG et le développement folliculaire. Enfin, un modèle de CG provenant de vaches en période post-partum a été utilisé pour mieux comprendre le contrôle de l’activité des CG. Des analyses complémentaires avec ce modèle ont révélé une réduction significative de TRIB2 chez les vaches ayant un taux élevé de BHB (>1.4mmol/L) comparé à celles ayant un faible taux de BHB (<1.2mmol/L). Cette réduction était concomitante à une augmentation d’interleukines pro-inflammatoires et une réduction d’interleukines anti-inflammatoires dans les CG. L’ensemble de ces résultats supporte un rôle de TRIB2 dans la modulation de la signalisation MAPK dans les CG, apporte une preuve solide que TRIB2 pourrait agir comme un régulateur de la prolifération et de la fonction des CG et de l’expression de gènes cibles, et suggère que TRIB2 pourrait affecter la stéroïdogenèse au cours du développement folliculaire et lors de la période post-partum. / During the processes of follicular growth and ovulation, steroidogenic cells, including granulosa
cells, play a crucial role in the maturation and release of the oocyte. Our lab identified and
characterized for the first time tribble pseudokinase 2 (TRIB2) in GC of ovarian follicles. Previous
studies have shown that TRIB2 plays a role in the coordination of mitosis and morphogenesis in
Drosophila while in mice its expression in cumulus cells is linked to oocyte maturation. However,
the exact mechanism of action of TRIB2 as well as its function and effects on signaling pathways
in GC during follicular growth remained to be defined. This study aimed therefore to further
investigate TRIB2 function and identify its binding partners in GC. TRIB2 inhibition and
overexpression experiments were conducted using, respectively, CRISPR/Cas9 technology and the
pQE1 system. Using an in vivo model consisting of GC obtained from follicles at different stages
of development, we demonstrated a downregulation of TRIB2 by the endogenous luteinizing
hormone (LH) and human Chorionic Gonadotropin (hCG) at both the messenger and protein levels.
In addition, analyzes using an in vitro model of cultured GC, we showed that FSH stimulates the
expression of TRIB2 while inhibition of TRIB2 via CRISPR-Cas9 resulted in a significant
reduction in GC proliferation (P<0.05). Western blot analyzes showed an increase in the
phosphorylation levels of ERK1/2 (MAPK3/1) and p38MAPK (MAPK14) following TRIB2
overexpression. These results suggested a role of TRIB2 in follicular growth and modulation of
MAPK pathways. In the second part of the thesis, we identified CALM1, INHBA, INPPL1, NT5E,
SCD, SDHB and RAB14 as binding partners of TRIB2 in GC using the yeast two-hybrid approach.
RT-qPCR analyzes showed that all of these partners are present in the dominant follicles but are
differently regulated during follicular development. Moreover, TRIB2 manipulation (inhibition or
overexpression) results in a different regulation (up- or down-regulation) of these partners
expression in GC. These results suggest a role of TRIB2 in the regulation of effector targets genes
related to follicular development and GC activity. In the third part of the thesis, a GC model from
postpartum cows was also used to better understand the control of GC activity. Further analyses
using this model revealed a significant decrease of TRIB2 in cows with high level of BHB (>1.4
mmol/L) as compared to those with a low BHB levels (<1.2 mmol/L). This reduction of TRIB2
was concomitant with an increase in pro-inflammatory interleukins and a reduction in anti-inflammatory interleukins in GC. Overall, these results support a role of TRIB2 in the modulation
of MAPK signaling in GC, provide strong evidence that TRIB2 could act as a regulator of GC
proliferation and function as well as expression of target genes in GC, and suggests that TRIB2
might affect steroidogenesis during follicular development and during the post-partum period.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/26963 |
| Date | 11 1900 |
| Creators | Warma, Aly |
| Contributors | Ndiaye, Kalidou |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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