A raiva é uma zoonose quase sempre fatal, que causa milhares de mortes humanas por ano em todo mundo. Essa enfermidade manifesta-se nos mamíferos em duas formas clínicas: furiosa e paralítica. Distinções em relação à evolução, manifestações clínicas, lesões, distribuição e respectiva carga viral no Sistema Nervoso Central (SNC) podem estar relacionadas às características de neuroinvasividade e neuropatogenicidade das diferentes variantes do vírus da raiva (RABV). O objetivo deste projeto foi estabelecer um modelo para o estudo da patogênese da raiva em camundongos inoculados com vírus fixo CVS/31 e variantes de rua do RABV originárias de bovino (variante 3 compatível com isolados de morcegos hematófagos) e de canídeo silvestre (variante compatível com isolados de canídeo silvestre). Para estabelecer o modelo murino, 24 camundongos isogênicos da linhagem BALB/c, de três semanas de idade foram inoculados com 103 DLIC50/0,03mL por via intracerebral (IC) para confirmar a neurovirulência das diferentes variantes do RABV. De modo concomitante, 32 camundongos desta mesma linhagem e faixa etária, foram inoculados com 105 DLIC50/0,03mL pela via coxim plantar (CP) com o intuito de mimetizar a progressão da infecção natural. Para o estudo da patogênese do RABV foram analisados durante um período de trinta dias após a inoculação (DPI) em camundongos pela via CP os seguintes parâmetros: manifestações clínicas, alterações histopatológicas, distribuição antigênica viral pela técnica de imuno-histoquímica (IHQ) e distribuição de RNA viral pela técnica da reação em cadeia da polimerase em tempo real precedida pela transcrição reversa (RT-qPCR) - sistema SYBR Green em diversos segmentos do SNC. Todos os camundongos inoculados com as três amostras do RABV apresentaram sintomas compatíveis com a forma paralítica da doença, tais como: piloereção, perda de peso, postura arqueada, prostração e paresia dos membros posteriores. Apesar de não ser possível observar diferenças de neuropatogenicidade entre as variantes virais, detectaram-se diversidade de virulência entre essas estirpes, demonstrado pelas distinções de período de incubação e taxa de letalidade. Ao analisar os resultados, também foi possível observar diferenças entre a neurovirulência e a neuroinvasividade das diferentes variantes do RABV. Nos camundongos inoculados com CVS/31 pela via CP, no 6º DPI, observaram-se predomínio de manguitos perivasculares na medula espinhal e degeneração neuronal em córtex e intensa distribuição antigênica de RABV no tronco encefálico. Nos camundongos inoculados via CP com amostras do RABV originárias de bovino, no 8º DPI, apresentaram moderada distribuição de manguitos perivasculares na medula e córtex e intensa distribuição antigênica no tálamo. Já nos animais inoculados com a amostra de canídeo silvestre, no 9ºDPI, relataram-se moderada distribuição de manguitos perivasculares no tronco encefálico e moderada distribuição antigênica no córtex. Além disso, foi observado discrepâncias na comparação entre a intensidade e distribuição de marcações antigênicas pela IHQ e inferência semi-quantitativa de distribuição de RNA viral analisada pelo RT-qPCR-sistema SYBR Green no SNC de camundongos / Rabies is a zoonotic disease usually fatal, causing thousands of human deaths each year worldwide. This disease manifests itself in mammals in two clinical forms: furious and paralytic. Distinctions regarding the evolution, clinical manifestations, injuries, distribution and their viral load on the central nervous system (CNS) may be related to the characteristics of neuroinvasiveness and neuropathogenicity of different variants of rabies virus (RABV). The objective of this project was to establish a model to study the pathogenesis of rabies in mice inoculated with fixed virus CVS / 31 and RABV Street variants originating from bovine (variant 3 - compatible with isolates from vampire bats) and wild canid (variant supports isolated from wild canid). To establish the mouse model, 24 mice of the inbred strain BALB/c, three weeks old were inoculated with 103DLIC50/0,03mL intracerebrally (IC) to confirm the neurovirulence of the different variants of RABV. Concomitantly, 32 mice of the same lineage and age were inoculated with 105DLIC50/0,03mL via footpad (CP) in order to mimic the natural progression of the infection. To study the pathogenesis of RABV CP the following parameters were analyzed over a period of thirty days after inoculation (DPI) in mice via CP: clinical, histopathological changes, viral antigen distribution by the technique of immunohistochemistry (IHC) and distribution of RNA by real-time polymerase chain reaction technique preceded by reverse transcription (RT-qPCR) - SYBR Green system in various segments of the CNS. All mice inoculated with the three RABV samples showed symptoms consistent with the paralytic form of the disease, such as ruffled fur, weight loss, hunched, prostration and paresis of the hind limbs. Although it is not possible to observe neuropathogenicity differences between viral variants, the virulence diversity is detected between these strains demonstrated by distinctions incubation period and fatality rate. When analyzing the results, it was also possible to observe differences between neurovirulence and neuroinvasiveness of different variants of RABV. In mice inoculated with CVS/31 via CP on the 6th DPI, there were predominance of perivascular cuffing in spinal cord and neuronal degeneration in cortex and intense antigenic distribution of the RABV in the brainstem. Mice inoculated via CP with RABV samples originating from bovine on the 8thDPI had moderate distribution of perivascular cuffing in the medulla and cortex and intense antigenic distribution in the thalamus. The animals inoculated with the sample of wild canid in 9thDPI reported a moderate perivascular cuffing distribution in the brainstem and moderate antigenic distribution in the cortex. Additionally, discrepancies were observed when comparing the intensity and distribution of antigenic tags by IHC, semi-quantitative inference viral RNA distribution analyzed by RT-qPCR using SYBR Green system in the mouse CNS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-16092015-123105 |
| Date | 13 July 2015 |
| Creators | Gamon, Thaís Helena Martins |
| Contributors | Mori, Enio |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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