Le manque de protéine soluble est souvent un obstacle à la caractérisation structurale des protéines. Une approche courante pour surmonter cela consiste à isoler des domaines protéiques en utilisant des méthodes itératives de création et analyse de constructions. Autrement des banques d'ADN, contenant toutes les constructions possibles d'une même protéine, peuvent être crée par troncation enzymatique et testée à la fois pour l'expression et la solubilité de celle-ci. Dans ce projet, la nouvelle méthode d'Expression des Protéines Solubles par Troncation Aléatoire Incrémentielle (ESPRIT) a été utilisée pour explorer la définition des domaines protéiques. Des protéines kinases multidomaines qui avaient échoué surexpression solubles ont été choisies pour leur intérêt biologique. La méthode a d'abord été optimisée pour améliorer la qualité et l'efficacité des banques permettant un meilleur traitement de la diversité générée. Elle a ensuite été appliquée à une protéine kinase modèle DAPK1, à partir de laquelle une définition précise de domaine a été démontrée. Le criblage des constructions a ainsi permis l'identification de protéines plus stables, et cristallisation des constructions dans les conformations alternatives. La méthode a aussi été appliquée pour identifier des variants solubles du complexe DAPK1 et son partenaire la calmoduline, permettant de mettre en évidence un domaine d'interaction minimal, plus petit que celui décrit auparavant. Alors que plusieurs tentatives pour obtenir le domaine catalytique kinase de IKKb avaient échoué, des criblages additionnels sur cette protéine avec cette méthode ont permis d'identifier des domaines de régulation solubles et fonctionnels in vivo. Enfin, il a été démontré que des constructions du domaine catalytique de p110b, faiblement exprimées dans E.coli, pouvaient être exprimées solubles dans des cellules d'insectes avec des rendements plus importants.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00600643 |
| Date | 15 December 2009 |
| Creators | Yumerefendi, Hayretin |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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