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Previous issue date: 2015-07-24 / Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) is the causal agent of grapevine bacterial canker. In the Submédio do Vale São Francisco in the northeast of Brazil, bacterial canker is one of the most important grapevine diseases, responsible for severe damage and representing a serious risk to Brazilian viticulture and wine production. The aims of this study were to: a) evaluate the ability of seven Xcv strains to adhere and form biofilms in vitro and to determine the influence of the culture medium and surfaces on biofilm formation, besides to study the biofilm architecture and swarming motility; and b) optimize a method of protein extraction for proteomic analysis of the Xcv, comparing the efficiency of four methods, based on the twodimensional gel electrophoresis profile (2D-PAGE). All the strains adhered to the wells of the polystyrene microtiter plate and formed biofilms in all liquid culture medium (nutrient brothdextrose- yeast extract, yeast extract-dextrose-calcium carbonate, KADO 523 and Luria-Bertani), though to different degrees (weak, moderate and strong). In glass tubes, only Xcv229 and Xcv158 strains formed biofilms. We identified Xcv229 as a strong biofilmproducing strain. Using confocal laser scanning microscopy (CLMS) only Xcv229 showed an initial matrix of biofilm structure after 24 h of growth. Scanning electron microscopy (SEM) images of strains Xcv229 and Xcv158 grown for 36 h on microtiter plates revealed typical biofilm architectures. Strain Xcv158 displayed a higher swarming motility than Xcv229, showing that in this case, biofilm formation is not motility-dependent. This is the first report of biofilm production by the bacterial plant pathogen Xcv. Trizol®, Phenol, Centrifugation and Lysis methods were tested and through quantitative and qualitative analysis, the most suitable method to obtain high-quality protein was selected. All methods enabled the extraction of a significant amount of proteins; nevertheless, the centrifugation method allowed obtaining the highest concentration of solubilized proteins. However, the analysis of the 2D-PAGE gel images revealed a larger number of spots in the lysis method when compared to the others. Taking into consideration the quality of the results and the practical advantages of the lysis method, this is recommended as the best option for total protein extraction of Xcv for proteomic studies. / Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) é o agente causal do cancro bacteriano da videira. No Submédio do Vale São Francisco, no nordeste do Brasil, o cancro bacteriano é uma das doenças mais importantes dessa cultura, sendo responsável por grandes prejuízos, o que representa um sério risco para a viticultura brasileira. Os objetivos deste estudo foram: a) avaliar a capacidade de sete isolados de Xcv para aderir e formar biofilmes in vitro e determinar a influência do meio de cultura e das superfícies na formação de biofilme, além de investigar a arquitetura do biofilme e motilidade swarming; e b) otimizar um protocolo para extração de proteínas para análise da proteômica de Xcv, comparando a eficiência de quatro métodos com base no perfil de eletroforese em gel bidimensional (2D-PAGE). Todos os isolados aderiram aos poços da placa de microtitulação de poliestireno e formaram biofilmes nos meios de cultura líquidos testados (caldo nutriente-dextrose-extrato de levedura, extrato de levedura-dextrose-carbonato de cálcio, KADO 523 e Luria-Bertani), em níveis fraco, moderado e forte. Em tubos de vidro, apenas os isolados Xcv229 e Xcv158 formaram biofilmes. Xcv229 foi considerado um forte produtor de biofilme. Na microscopia confocal a laser (MCL) apenas em Xcv229 visualizou-se a matriz inicial da estrutura do biofilme, após 24 h de crescimento. As imagens da microscopia eletrônica de varredura (MEV) de Xcv229 e Xcv158 crescidos durante 36 h em placas de microtitulação revelaram arquiteturas típicas de biofilme. O isolado Xcv158 apresentou uma maior motilidade swarming do que Xcv229, mostrando que, neste caso, a formação de biofilme é independente da motilidade. Este é o primeiro relato de produção de biofilme bacteriano pela fitobactéria Xcv. Os métodos Trizol®, fenol, centrifugação e lise foram analizados quantitativa e qualitativamente, para selecionar o mais adequado na obtenção de proteína de alta qualidade. Todos permitiram a extração de uma quantidade significativa de proteínas, no entanto, o método de centrifugação resultou numa maior concentração de proteínas solubilizadas. A análise das imagens do gel 2D-PAGE revelou um maior número de spots no método de lise, quando comparado com os outros. Levando-se em consideração a qualidade dos resultados e as vantagens práticas do método de lise, este é recomendado como a melhor opção para extração de proteínas totais de Xcv para estudos de proteômica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2:tede2/6675 |
| Date | 24 July 2015 |
| Creators | GUERRA, Myrzânia de Lira |
| Contributors | SOUZA, Elineide Barbosa de, SILVA, Márcia Vanusa da, PEIXOTO, Ana Rosa, OLIVEIRA, Janaina Cortês de, LARANJEIRA, Delson, GAMA, Marco Aurélio |
| Publisher | Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, UFRPE, Brasil, Departamento de Agronomia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRPE, instname:Universidade Federal Rural de Pernambuco, instacron:UFRPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 1343367238723626701, 600, 600, 600, -6800553879972229205, -6207026424523013504 |
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