NASCIMENTO, A.S. F. Expressão, purificação e caracterização estrutural da bdh-2 recombinante, uma espermadesina presente no plasma seminal de bode (Capra hircus). 2010. 84 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Curso de Medicina, Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral , 2010. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-03-21T14:38:25Z
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Previous issue date: 2010-02-02 / The Bdh-2 bodhesin cDNA present in seminal plasma of goat was subcloned in the expression plasmid pTrcHis TOPO used to transform E. coli Top10 One shot cells. The recombinant clones were selected by growth in 50 μg/mL ampicillin-containing LB-Broth medium and PCR amplifications. The recombinant protein synthesis was monitored by SDS-PAGE followed by immunoblotting using monoclonal anti-His antibody. The production of the rBdh-2 through low temperature was not satisfactory. A greater production of the rBdh-2 occurred with IPTG 1.5 mM after 2 h of induction. The method utilized to the purification of the rBdh-2 was realized in affinity chromatography on a His-Trap column following ion-exchange chromatography on a DEAE-Sephacel column. The secondary structure of the rBdh-2 was evaluated through spectral profile circular dichroism (CD) and confirmed the prevalence of secondary structures like β-sheets, the presence of a low content of unfolded structures and helices-. The rBdh-2 structure remained stable up to 35 °C. However, significant changes were observed from 40 °C related to a distortion of the spectrum of CD. / O cDNA da bodesina Bdh-2 presente no plasma seminal de caprino (Capra hircus) foi subclonado no vetor de expressão pTrcHis TOPO utilizado para transformar células E.coli Top 10 One Shot. Os clones recombinantes foram selecionados através de crescimento em meio LB-Broth contendo 50 μg/mL de ampicilina e amplificação do gene por PCR. A síntese da proteína recombinante rBdh-2 fusionada com cauda de histidina foi monitorada através de SDS-PAGE seguido por immunobloting usando anticorpo monoclonal anti histidina. A produção da rBdh-2 através da indução a baixas temperaturas não se mostrou satisfatória. A maior produção da rBdh-2 ocorreu com IPTG 1,5 mM após 2 horas de indução. O método utilizado para a purificação da proteína recombinante rBdh-2 foi através de cromatografia de afinidade em coluna His-Trap seguida por cromatografia de troca-iônica em coluna de DEAE-Sephacel. A estrutura secundária da rBdh-2 foi avaliada através do perfil espectral de dicroísmo circular (CD) que confirmou a predominância de estruturas secundárias do tipo folhas-β, a presença de um baixo conteúdo de estruturas não-ordenadas e de hélices-. A rBdh-2 manteve sua estrutura estável até 35 °C. No entanto, mudanças significativas foram observadas a partir de 40 °C referentes à descaracterização do espectro de CD.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/15683 |
| Date | 02 February 2010 |
| Creators | Nascimento, Antonia Sâmia Fernandes do |
| Contributors | Cavada, Benildo Sousa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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