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Previous issue date: 2011-01-20 / Lignocellulosic materials are abundant in agro-industrial residues and by-products of agroindustry
and can be used for fuels and other chemicals of commercial interest. An alternative
to physical and chemical methods for bioconversion of lignocellulosic material is the use of
enzymes produced by micro-organisms. The aquatic bacterium Gram negative Caulobacter
crescentus presents biotechnological potential for the use of these residues because it
contains in its genome several gene coding for enzymes involved in the metabolism of
lignocellulosic materials, including 5 genes to β-Xylosidases. In this study, the gene xynB2
(1.5 kb) coding the C. crescentus β-Xylosidase II was cloned into the vector pJet1.2
(Fermentas) and subcloned in frame in the sites EcoRI/XbaI of expression vector pPROEXHta
(Invitrogen). A histidine tail fusion protein was obtained after induction and expression of
gene xynB2 in E. coli (DH10B) with IPTG (1 mM). The recombinant β-Xylosidase II (β-Xylrec-
II) was purified by chromatography using nickel-Sepharose resin and a pure enzyme was
characterized by biochemical kinetics parameters. A single band of 65 kDa was obtained by
SDS-PAGE 9% for C. crescentus β-Xyl-rec-II purified, which showed a specific activity of
215 U / mg, pH optimum equal to 6, the optimum temperature of 55 °C and half life of 4 h at
50 °C. After 24 h incubation at pH 6 the enzyme retained 95% of activity. Most of the ions
inhibited the activity of β-Xylosidase II, but a 32% increase was observed in the presence of
KCl (2mM). The kinetic parameters KM and VMáx were equal to 8.4 mM and 370 moles / min,
respectively. The ability of C. crescentus β-Xyl-rec-II hydrolyse xylan and sugarcane bagasse
residue was assessed after incubation with these Xylanase purified from Aspergillus
alliaceus. The relative percentage of hydrolysis products of xylan and sugar cane bagasse,
increased 2.5 and 6.5 times, respectively, after incubation for 18 hours with C. crescentus β-
Xyl-rec-II pure, thus highlighting the possibility of using this enzyme in biotechnological
processes. In addition, β-Xil-rec-II was also used for the production of a polyclonal antibody
in rabbit that showed by "Western blot" assay a highly specific recognition of the purified
protein. In order to investigate the role of xynB2 gene to C. crescentus, two mutants were
obtained. The first one was constructed by insertion of a spectinomycin resistance cassette
into the xynB2 gene by double homologous recombination, generating a null mutant strain
named RSJU-2. The second one was obtained by cloning of xynB2 gene under the control of
the inducible xylose promoter generating a strain denominated pMOA. β-Xylosidase activity
was measured in the RSJU-2, pMOA and parental strain (NA1000) cells of C. crescentus
which were grown in the absence and in the presence of different agro-industrial residues
and others carbon sources. The xynB2 gene depletion made cells more able to produce high
activities of other β-Xylosidases in the presence of different residues, for instance, β-
Xylosidase activity produced by RSJU-2 cells was almost 15 times higher than the activity
showed by NA1000 in the presence of sugarcane bagasse. These results indicate that the
absence o xynB2 gene up-regulates the expression of other β-Xylosidases in C. crescentus.
On the other hand, a decreased activity of β-Xylosidase was observed in the strain pMOA,
suggesting that the overexpression of β-Xylosidase II down-regulates C. crescentus β -
Xylosidases activities. To verify that the variation in activity levels of β -Xylosidase occur as a
consequence of variations in the levels of transcription of β-Xylosidases genes in different
strains, we constructed a lacZ- fusion transcription by cloning the E. coli lacZ gene under the
control of xynB2 gene promoter. Thus, the β-Galactosidase activity was measured as a
function of xynB2 promoter activity. Tests of promoter activity by measuring the activity of β-
Galactosidase in different strains showed that the xynB2 gene is transcription-dependent. / Materiais lignocelulósicos são abundantes em resíduos agroindustriais e subprodutos da
agroindústria e podem ser usados para produção de combustíveis e outros químicos de
interesse comercial. Uma alternativa aos métodos físicos e químicos para bioconversão de
material lignocelulósico é o uso de enzimas produzidas por micro-organismos. A bactéria
aquática Gram negativa Caulobacter crescentus apresenta potencial biotecnológico para o
uso destes resíduos por conter em seu genoma vários genes que codificam para enzimas
envolvidas com o metabolismo de materiais lignocelulósicos, incluindo 5 genes para β-
Xilosidases. No presente trabalho o gene xynB2 (1,5 kb), que codifica para a β-xilosidade II
de C. crescentus, foi clonado no vetor pJet1.2 (Fermentas) e subclonado em fase de leitura
nos sítios EcoRI/XbaI do vetor de expressão pPROEX-HTa (Invitrogen). Uma proteína de
fusão com cauda de histidinas foi obtida após indução da expressão do gene xynB2 em E.
coli (DH10B) com IPTG (1mM). A β-xilosidade II recombinante (β-Xil-II-rec) foi purificada por
cromatografia usando resina de níquel-sepharose e a enzima pura caracterizada quanto a
parâmetros cinéticos e bioquímicos. Uma banda única de 65 KDa foi obtida em gel SDSPAGE
9% para a β-Xil-rec-II purificada de C. crescentus, a qual mostrou uma atividade
específica de 215 U/mg, pH ótimo igual a 6, temperatura ótima de 55°C e meia vida de 4
horas a 50°C. Após 24 h de incubação em pH 6 a enzima reteve 95% da atividade inicial. A
maioria dos íons inibiu a atividade de β-xilosidade II, mas um aumento de 32% foi observado
na presença de KCl (2mM). Os parâmetros cinéticos KM e VMáx foram iguais a 8,4 mM e 370
moles/min, respectivamente. A capacidade da β-Xilosidase II recombinante pura de C.
crescentus hidrolisar xilano e o resíduo bagaço de cana foi avaliada após incubação prévia
destes com a Xilanase purificada de Aspergillus alliaceus. As porcentagens relativas de
produtos de hidrólise do xilano e bagaço de cana-de-açúcar aumentaram 2,5 e 6,5 vezes,
respectivamente, após incubação por 18 horas com a β-Xil-II-rec pura de C. crescentus,
ressaltando assim, a possibilidade de aplicação desta enzima em processos
biotecnológicos. Em adição, a β-Xil-II-rec foi usada para a produção de um anticorpo
policlonal em coelho que mostrou por ensaios de Western Blot uma elevada especificidade
para reconhecimento da proteína purificada. Paralelamente, com o objetivo de investigar o
papel do gene xynB2 para C. crescentus, dois mutantes foram obtidos. O primeiro foi
construído pela inserção de um cassete de resistência a espectinomicina dentro do gene
xynB2 por dupla recombinação homóloga, gerando uma linhagem mutante nula denominada
RSJU-2. Os segundo foi obtido por clonagem do gene xynB2 sob o controle de um promotor
indutível por xilose gerando uma linhagem denominada pMOA. A atividade de β-Xilosidase
foi mensurada nas células das linhagens RSJU-2, pMOA e parental (NA1000) de C.
crescentus, as quais cresceram na ausência e presença de diferentes resíduos
agroindustriais. A depleção do gene xynB2 fez as células mais hábeis a produzirem altas
atividades de outras β-Xilosidases na presença de diferentes resíduos ou fontes de carbono.
Estes resultados indicam que a ausência do gene xynB2 regula positivamente a expressão
de outras β-Xilosidases em C. crescentus. Por outro lado, um decréscimo na atividade de β-
Xilosidases foi observado na linhagem pMOA, sugerindo que a superexpressão da β-
XilosidaseII regula negativamente a atividade de β-Xilosidases. Para verificar se a variação
nos níveis de atividade de β-Xilosidase ocorre como um reflexo de variações nos níveis de
transcrição de genes de β-Xilosidases nas diferentes cepas, foi construído uma fusão de
transcrição a partir da clonagem do promotor do gene xynB2 a frente do gene lacZ de E.
coli. Assim, foi quantificada a atividade de β-Galactosidase como uma medida da atividade
do promotor do gene xynB2, o que demonstrou que gene xynB2 é dependente de
transcrição.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.unioeste.br:tede/362 |
| Date | 20 January 2011 |
| Creators | Corrêa, Juliana Moço |
| Contributors | Fortes, Rita das Graças Felix |
| Publisher | Universidade Estadual do Oeste do Parana, Programa de Pós-Graduação "Stricto Sensu" em Engenharia Agrícola, UNIOESTE, BR, Engenharia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do UNIOESTE, instname:Universidade Estadual do Oeste do Paraná, instacron:UNIOESTE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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