Apparues il y a environ trois milliards d'années, les cyanobactéries ont façonné notre planète, en produisant l’atmosphère oxygénique. De nos jours, les cyanobactéries sont les organismes photosynthétiques les plus abondants dans notre environnement, elles assurent environ 30 à 40% de la production d'O2, et de la consommation du CO2 par les océans et constituent le premier maillon de la chaîne alimentaire. A part la photosynthèse, leur métabolisme est encore très mal connu. Ainsi, pour mieux comprendre le métabolisme cyanobactérien et proposer des stratégies de reprogrammation, il est primordial de développer des méthodes analytiques permettant l’étude globale de leur métabolisme en réponse à des variations de conditions environnementales et de stress. La cyanobactérie modèle Synechocystis PCC6803 convient parfaitement à ce type d’analyse. En effet, Synechocystis est un unicellulaire, hétérotrophe facultative capable de se développer en eau douce ou saumâtre et à un pH alcalin. Synechocystis possède un petit génome d’environ 4.0 Mb entièrement séquencé et facilement manipulable grâce aux outils développés au laboratoire. Son génome prédit l'existence d'un métabolisme carboné complexe mais encore peu étudié. Mon travail de thèse est centré sur cette analyse par la combinaison de deux approches, la génomique fonctionnelle et la métabolomique. Durant ma thèse en collaboration avec le LEMM dirigé par Christophe Junot iBiTec-S/SPI, j’ai développé un protocole d’extraction des métabolites de Synechocystis, ainsi qu’une méthode d’analyse métabolomique par couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse LTQ-Orbitrap à haute résolution. L’application de cette nouvelle méthode analytique m’a permis d’étudier l’influence de la lumière et du glucose sur le métabolisme de Synechocystis. Ainsi, j’ai montré que Synechocystis cultivée en présence du glucose reprogramme fortement son métabolisme. Parmi les résultats très intéressants, j’ai montré que le glucose engendre un stress oxydant. Chez tous les organismes, une forte activité du métabolisme carboné entraîne la production de métabolites toxiques tels que le méthyglyoxal (MG). Le MG modifie irréversiblement de nombreuses bio-molécules. Dans le cadre de ma thèse, j’ai commencé à m’intéresser à l'effet du MG sur la physiologie et le métabolisme de Synechocystis. J'ai construit 25 mutants KO pour les gènes de la glycolyse et du métabolisme du glycérol permettant de moduler la concentration intracellulaire de MG et également les gènes impliqués dans les voies de détoxication du MG dont celle dépendante de la synthèse du GSH (la voie des glyoxalases). J’ai pu montrer que les gènes responsables de la synthèse du GSH sont essentiels à la viabilité cellulaire. Je suis parvenu toutefois à obtenir un mutant déplété de gshB et ne produisant plus de GSH à un niveau détectable. En faisant une analyse métabolomique approfondie, j’ai mis en évidence pour la première fois que Synechocystis était capable produire deux tripeptides non-thiolés analogues structuraux du GSH; l’acide ophthalmique et l’acide norophthalmique identifiés jusqu’à présent uniquement chez les mammifères. La comparaison des métabolomes de culture de souches sauvage, ou dépletées en gshA, gshB ou ggt, a permis de montré que ces analogues sont synthétisés par les mêmes enzymes que le GSH à savoir GshA et GshB. Par ailleurs, une autre molécule anti-oxydante dont la synthèse est connue chez quelques champignons et qui s’accumule chez l’Homme par l’apport alimentaire a également été observée. / Cyanobacteria are fascinating microorganisms. They are among the oldest life forms, regarded as the progenitors of the oxygenic photosynthesis and plant chloroplast. Furthermore, cyanobacteria have evolved as the largest and most diverse groups of bacteria in colonizing most marine and fresh waters, as well as soils. An important reason for the hardness of cyanobacteria is their successful combination of effective metabolic pathways driven by their efficient photosynthesis that uses nature's most abundant resources, solar energy, water and CO2, to produce a large part of the Planet's oxygenic atmosphere and organic assimilates for the food chain. Hence, cyanobacteria are receiving a growing attention because of their potential for the carbon-neutral production of biofuels and bioplastics. To better understand cyanobacteria and turn their biotechnological potentials into an industrial reality, we need to develop robust protocols for global analysis of their metabolism and its responses to environmental stresses. The model cyanobacterium Synechocystis PCC6803 is well suited for this purpose. Synechocystis is a basic organism, i.e. unicellular, which grows well (i) in fresh- and marine-waters; (ii) in the presence of glucose that can compensate for the absence of light; and (iii) at high pH that prevents microbial contaminations. Furthermore, Synechocystis harbors a small sequenced genome (about 4.0 Mb), which can be easily manipulated. In the present work, we developed a robust protocol for metabolome analyses of Synechocystis, using liquid chromatography (LC) for metabolite separation, coupled to a LTQ-Orbitrap mass spectrometer that provides high sensitivity and resolution, accurate mass measurements, and structural informations with MS/MS or sequential MSn experiments that facilitate metabolite identification. Consequently, we applied the PFPP-LC/MS method to analyze the metabolome of Synechocystis growing under various conditions of light and glucose, which strongly influence cell growth. We found that glucose increases glucose storage and catabolism, while it decreases the Calvin-Benson cycle that consumes photosynthetic electrons for CO2 assimilation. Depending on light and glucose availabilities, this global metabolic reprogramming can generate an oxidative stress, likely through the recombination of the glucose-spared electrons with the photosynthetic oxygen thereby producing toxic reactive oxygen species. Furthermore, we studied the metabolism of an endogenous toxic the méthylglyoxal and its main catabolic pathway going through the glyoxalases system glutathione dependent.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012PA112099 |
| Date | 21 June 2012 |
| Creators | Narainsamy, Kinsley |
| Contributors | Paris 11, Cassier-Chauvat, Corinne |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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