Les cellules endothéliales forment une couche semi-perméable entre le sang et les
organes. La prolifération, la migration et la polarisation des cellules endothéliales sont
essentielles à la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, soit
l’angiogenèse. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) peut activer la
synthase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS) et induire la production de monoxyde
d’azote (NO) nécessaire pour la régulation de la perméabilité vasculaire et l’angiogenèse. β-
caténine est une composante essentielle du complexe des jonctions d’ancrage ainsi qu’un
régulateur majeur de la voie de signalisation de Wnt/β-caténine dans laquelle elle se joint au
facteur de transcription TCF/LEF et module l’expression de nombreux gènes, dont certains sont
impliqués dans l’angiogenèse. La S-nitrosylation (SNO) est un mécanisme de régulation posttraductionnel
des protéines par l’ajout d’un groupement nitroso au niveau de résidus cystéines.
Le NO produit par eNOS peut induire la S-nitrosylation de la β−caténine au niveau des jonctions
intercellulaires et moduler la perméabilité de l’endothélium. Il a d’ailleurs été montré que le NO
peut contrôler l’expression génique par la transcription. Le but de cette thèse est d’établir le rôle
du NO au sein de la transcription des cellules endothéliales, spécifiquement au niveau de
l’activité de β-caténine.
Le premier objectif était de déterminer si la SNO de la β-caténine affecte son activité
transcriptionnelle. Nous avons montré que le NO inhibe l’activité transcriptionnelle de β-
caténine ainsi que la prolifération des cellules endothéliales induites par l’activation de la voie
Wnt/β-caténine. Il est intéressant de constater que le VEGF, qui induit la production de NO via
eNOS, réprime l’expression de AXIN2 qui est un gène cible de Wnt s’exprimant suite à la
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stimulation par Wnt3a et ce, dépendamment de eNOS. Nous avons identifié que la cystéine 466
de la β-caténine est un résidu essentiel à la modulation répressive de son activité
transcriptionnelle par le NO. Lorsqu’il est nitrosylé, ce résidu est responsable de la perturbation
du complexe de transcription formé de β-caténine et TCF-4 ce qui inhibe la prolifération des
cellules endothéliales induite par la stimulation par Wnt3a.
Puisque le NO affecte la transcription, nous avons réalisé l’analyse du transcriptome afin
d’obtenir une vue d’ensemble du rôle du NO dans l’activité transcriptionnelle des cellules
endothéliales. L’analyse différentielle de l’expression des gènes de cellules endothéliales montre
que la répression de eNOS par siRNA augmente l’expression de gènes impliqués au niveau de
la polarisation tels que : PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 et TJ3. Cette analyse suggère que le
NO peut réguler la polarisation des cellules et a permis d’identifier des gènes responsables de
l’intégrité des cellules endothéliales et de la réponse immunitaire. De plus, l’analyse de voies
de signalisation par KEGG montre que certains gènes modulés par l’ablation de eNOS sont
enrichis dans de nombreuses voies de signalisation, notamment Ras et Notch qui sont
importantes lors de la migration cellulaire et la différenciation des cellules de têtes et de tronc
(tip/stalk). Le regroupement des gènes exprimés chez les cellules traitées au VEGF (déplétées
de eNOS ou non) révèle que le NO peut affecter l’expression de gènes contribuant au processus
angiogénique, dont l’attraction chimiotactique.
Notre étude montre que le NO module la transcription des cellules endothéliales et régule
l’expression des gènes impliqués dans l’angiogenèse et la fonction endothéliale. / induce the
production of nitric oxide (NO), which is critical for vascular permeability and angiogenesis.
β-catenin is an essential component of the adherens junction as well as Wnt/β-catenin signaling
pathway and it binds T-cell factor (TCF)/lymphoid enhancer factor, regulating expression of
numerous genes including those involved in angiogenesis. S-nitrosylation (SNO) is a
mechanism used by NO to regulate protein activity by adding a nitroso group to cysteine
residues. eNOS derived-NO is capable to induce SNO of β-catenin at cell-cell junction and
modulate endothelial permeability. Additionally, NO has been implicated in the transcriptional
control of gene expression. Therefore, the goals of our studies were to investigate the regulatory
roles of NO on transcription in endothelial cells, in particular to the modulation of the
transcriptional activity of β-catenin.
The objective of the first study is to investigate whether the SNO of β-catenin affect its
transcriptional activity. We found that NO inhibits β-catenin transcriptional activity and
endothelial cell proliferation induced by activation of Wnt/β-catenin signaling. Interestingly,
VEGF, which can activate eNOS to produce NO in endothelial cells, repressed Wnt3a-induced
expression of Wnt target gene AXIN2 in an eNOS-dependent manner. Moreover, we identified
that Cys466 on β-catenin is a critical residue for the repressive effects of NO on β-catenin
transcriptional activity. Furthermore, we showed that Cys466 is responsible for the disruption
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of β-catenin/TCF4 transcriptional complex, and NO-dependant inhibition of Wnt3a-simulated
endothelial cell proliferation.
Given the known effects of NO on transcription, whole transcriptome sequencing was
performed in order to understand the transcriptional regulation of NO in endothelial cells. By
analyzing gene differential expression in cells transfected with control and eNOS siRNA, we
show that eNOS knockdown upregulates the expression of genes involved in cell polarization,
such as PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 and TJ3. The up-regulation of these genes was
confirmed by qRT-PCR analysis, suggesting that NO may regulate cell polarization. The
analysis also showed that genes regulated by eNOS knockdown were involved in endothelial
cell integrity and immune response. In addition, KEGG signaling pathway analysis showed that
genes regulated by eNOS were enriched in many signal pathways including Ras signaling,
which are important for endothelial cell migration. Moreover, clustering of differentially
expressed genes in VEGF-treated cells and VEGF-treated eNOS-depleted cells revealed that
NO may affect expression of genes in angiogenesis in response to VEGF, including those genes
involved in chemotaxis.
Our studies show that NO affects transcription in endothelial cells and regulates
expression of genes involved in angiogenesis and endothelial cell function.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/15974 |
| Date | 07 1900 |
| Creators | Zhang, Ying |
| Contributors | Gratton, Jean-Philippe |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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