O câncer cervical é o segundo maior responsável por mortes atribuídas a câncer em mulheres e dados epidemiológicos tem demonstrado a associação entre a infecção do HPV e o desenvolvimento da neoplasia. Sabe-se que num dado momento da infecção pelo HPV, ocorre integração do genoma viral ao genoma da célula hospedeira e consequente hiperexpressão de dois oncogenes virais, E6 e E7, o que contribui fortemente para a transformação celular. O presente trabalho propõe o uso de vacinas terapêuticas expressando a oncoproteína E7 do HPV-16 geneticamente fusionada à porção amino terminal da flagelina FliCd de Salmonella enterica sv müenchen; e verificação de seu possível papel adjuvante. Vacinas de DNA foram construídas de modo a direcionar as proteínas hibridas ao espaço intracitoplasmático. A verificação da expressão in vitro foi feita utilizando transfecções de culturas celulares, seguida de imunofluorescência e imunodetecção. Em seguida, essas construções vacinais foram administradas em camundongos C57BL6. Ensaios de ELISPOT foram feitos para mensuração o nível de linfócitos T secretores de IFN-g. Os dados de imunofluorescência e imunodetecção demonstraram a correta expressão da proteína. Ensaios de proteção realizados com 5 x 106 células TC-1 administrada por via subcutânea mostraram 80% de proteção em camundongos que haviam recebido previamente 4 doses das vacinas de DNA por biobalística. Ensaios de ELISPOT mostraram em média 9 células do baço secretoras de IFN-g por 106 células do baço (INF-g+/106) responsivas ao peptídeo CD8 / E7 de forma específica. Nossos dados sugerem que a formulação vacinal possui um efeito terapêutico significativo frente ao desafio com as células tumorais TC-1. Em paralelo, foi construída a cepa de salmonela vacinal SL FlaE7 que não mostrou efeito protetor frente ao desafio com células TC-1. / The cervical cancer is the second major responsible for deaths attributed to cancer in women and epidemiologic data have been demonstrating the association between the infection of HPV and the development of this illness. It is known that in a certain moment of the infection with HPV, occurs the integration of the viral genome in the genome of the host cell and consequent over expression of two oncogenes, E6 and E7, it strongly contributes to the transformation of that cell. The present work proposes the use of DNA vaccines expressing the oncoprotein E7 of HPV-16 genetically fused to the portion A-terminal of the flagellin FliCd of Salmonella enterica sv müencheun and verification of your possible performance as adjuvant. The DNA vaccines were constructed in expression vector for eukaryotic to address the hybrid proteins to the intracitoplasmatic space. The verification of the expression in vitro was made using transfections of cellular cultures (COS-7) followed by immunofluorescence and western blot analyses. Soon after, those vaccines were injected in mice C57BL6 that were challenged then with 5^105 tumor cells TC-1 subcutaneous. ELISPOT assays were performed for measure the level of spleen cells secreting interferon g. The immunofluorescence and Western blot data are complementary demonstrating the correct expression of the protein. Protection assays showed 80% of protection in mice that had previously received 4 doses of the DNA vaccines in gene gun form. Assays of ELISPOT show 9 cells of the spleen secreting of IFN-g (average) for 106 cells of the spleen (INF-g /106). Our data suggest that the formulation of vaccines possesses a significant therapeutic effect front to the challenge with the tumor cells TC-1 accompanist splenocyte IFN-g secretory.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-16072009-151128 |
| Date | 29 April 2009 |
| Creators | Cerqueira, Otto Luiz Dutra |
| Contributors | Ferreira, Luis Carlos de Souza |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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