Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (MSC) pueden ser candidatas adecuadas para la
derivación de gametos in vitro debido a su abundancia y a su alto potencial de
diferenciación. La diferenciación de las células germinales es un proceso complejo que
requiere tanto de regulación endocrina y auto-paracrina en un entorno específico, como
de interacciones directas celulares proporcionadas por las células somáticas del testículo.
Las células de Sertoli (CS) juegan un papel esencial formando nichos para las células
germinales y proporcionando factores esenciales para su diferenciación. El objetivo del
presente estudio fue evaluar el efecto del co-cultivo de CS en la diferenciación de MSC
derivadas de tejido adiposo (MSC-TA) y medula ósea (MSC-MO) fetales bovinas hacia
linaje de células germinales. Las CS fueron aisladas desde parénquima de testículo de
toro adulto y fueron caracterizadas mediante cuantificación de la expresión del
biomarcador de CS, Wilms tumor 1 (WT1) y de los niveles de mRNA de Receptor de
Andrógeno (AR) utilizando citometría de flujo (FC) y PCR cuantitativo (Q-PCR). Las
MSC fueron aisladas desde tejido adiposo y médula ósea mediante adherencia al plástico
y posteriormente fueron co-cultivadas sobre monocapas de CS durante 21 días. Muestras
de cultivos celulares fueron obtenidas cada 7 días y analizadas para determinación de
niveles de mRNA de genes endógenos β-ACTINA y GAPDH, genes de pluripotencia
OCT4 y NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de
macho DAZL, SRY, PIWIL2 y STRA8 mediante Q-PCR. Adicionalmente se evaluó la
expresión de Dazl, Nanog y Oct4 mediante FC e IF. Una alta proporción (85,5%±5,5) de
CS fueron positivas para WT1. Los niveles mRNA DAZL y PIWIL2 aumentaron el día
14 de diferenciación en co-cultivos de MSC-TA/CS en comparación con los
monocultivos y co-cultivos de MSC-MO/CS. Los niveles de mRNA de NANOG fueron
activados en MSC-MO y MSC-TA co-cultivadas con CS luego de 7 y 14 días de cultivo.
Los niveles de mRNA de OCT4 aumentaron (P<0,05) el día 14 en los co-cultivos de
MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos. Los niveles de
mRNA de CD73 aumentaron (P<0,05) en los co-cultivos el día 21 en comparación con
los monocultivos de MSC-MO y MSC-TA, mientras los niveles de mRNA de CD105
disminuyeron (P<0,05) en el co-cultivo de MSC-TA/CS al día 21en comparación con el
monocultivos de MSC-TA. Adicionalmente, los niveles de mRNA de SCP3
disminuyeron (P<0,05) en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS el día 7 y
14 en comparación con el monocultivo de MSC-TA y no se detectó en el día 21. Los patrones de expresión génica en los co-cultivos sugieren que las MSC fetales bovinas
poseen potencial de diferenciación germinal y que las MSC-TA fetales bovinas tienen
mayor capacidad de diferenciación en comparación a las MSC-MO. Considerando la
disminución en la expresión de SCP3 en los co-cultivos, estos resultados sugieren que las
MSC alcanzaron un estado de diferenciación germinal premeiótico temprano / Mesenchymal stem cells (MSC) may be suitable candidates for in vitro gamete
derivation due to their abundant source and wide differentiation potential. Germ cell
differentiation requires endocrine and auto/paracrine regulation in a specific
environment, as well as direct cell-to-cell interactions provided by the somatic cells of
the testis. Sertoli cells (SC) play an essential role by forming niches and providing
essential factors for germ cell differentiation. The aim of the present study was to evaluate
the effect of co-culture of SC on the germ cell differentiation potential of bovine fetal
MSC derived from adipose tissue (MSC-TA) and bone marrow (MSC-BM). Sertoli cells
were isolated from bull testis parenchyma and characterized by quantification of
biomarker wilms tumor 1 (WT1) expression and androgen receptor (AR) mRNA levels
using flow-cytometry (FC) and quantitative-PCR (Q-PCR) analyses. bfMSC were
isolated from adipose tissue and bone marrow and were co-cultured over monolayers of
SC for 21 days. Cell culture samples were obtained every 7 days and analyzed for
endogenous genes β-ACTIN y GAPDH, pluripotency genes OCT4 y NANOG, germinal
genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germinal genes DAZL, SRY, PIWIL2 and
STRA8 using Q-PCR. A high (P < 0.05) proportion of SC (85,5%±5,5) were positive for
WT1 and expressed high levels of WT1 and AR mRNA levels. Levels of DAZL and
PIWIL2 mRNA were up-regulated at day 14 of differentiation in bfMSC-SC co-cultures
compared to monocultures and co-cultures of MSC-BM/CS. NANOG mRNA levels were
activated in MSC-BM and MSC-TA co-cultured with SC at days 7 and 14 of culture.
OCT4 mRNA levels increased (P <0.05) at day 14 in co-cultures of MSC-BM/CS and
MSC-TA/CS compared to monocultures. CD73 mRNA levels increased (P <0.05) in the
co-cultures at day 21. CD105 mRNA levels were decreased (P < 0.05) in the co-culture
of MSC-TA/CS at day 21 of culture compared to monoculture of MSC-TA. SCP3 mRNA
levels were down-regulated in the co-cultures of MSC-BM/CS and of MSC-TA/CS at 14
day compared to monoculture and were not detected at day 21. Thus, the gene expression
patterns in MSC suggest that they have the potential for germinal differentiation and that
bfMSC-TA have greater differentiation capacity towards germinal lineage in relation to
MSC-BM. Moreover, reduction in SCP3 mRNA throughout the process of germinal
differentiation suggest that MSC achieved an early premeiotic germ cell differentiation
state / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1161251.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/146609 |
| Date | January 2017 |
| Creators | Nunda Segunda, Moisés |
| Contributors | Peralta Troncoso, Oscar, Reyes Solovera, Mónica de los, Parraguez Gamboa, Víctor Hugo |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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