La pathogénicité de P. aeruginosa (P. a) repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SST3). Ce complexe multiprotéique est constitué d'une aiguille se terminant par un translocon composé des protéines PopB et PopD. En s'insérant dans les membranes plasmiques, le translocon permet le passage des exotoxines dans le cytoplasme de la cellule cible. L'induction de la synthèse et de la sécrétion des exotoxines est dépendante d'un contact entre P. a et la cellule cible. Dans ce travail, nous avons examiné l'influence de facteurs cellulaires sur l'efficacité de translocation des toxines. L'utilisation d'un système rapporteur fluorescent CCF2/β-lactamase a permis de visualiser l'injection de toxine. En parallèle, l'association des protéines du translocon avec la membrane de la cellule hôte a été évaluée par immunodétection de PopB/D après fractionnement des membranes sur gradient de sucrose. Les cellules promyelocytaires HL-60 et promonocytaires U937 sont résistantes à l'injection de toxine, bien que PopB et PopD soient associées à la membrane. Après différenciation en neutrophiles, or monocytes/macrophages, ces cellules deviennent sensibles à l'injection sans que l'on détecte de variation notable de la quantité de protéines du translocon insérées dans la membrane. Le traitement des cellules HL-60 sensibles avec un agent déplétant le cholestérol, entraine une diminution de l'injection de toxine. De plus, la protéine PopB est retrouvée dans la fraction membranaire, obtenue par purification sur gradient de sucrose, contenant le marqueur des radeaux lipidiques flotilline. Par une approche pharmacologique, nous apportons la preuve que, en plus de la composition de la membrane, des voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la polymérisation de l'actine sont essentielles pour la formation d'un pore fonctionnel. / The pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa (P.a) implies multiple virulence factors among which the type III secretion system (T3SS). This multiprotein complex is composed of a needle through which four exotoxins are exported. The protein PopB and PopD form an oligomeric structure (translocon) at the end of the needle that inserts into the host cell membrane and translocates the exotoxins into the cytoplasm. Synthesis and toxin secretion is induced on contact with eukaryotic cell. In this work, we examined the influence of host cell elements on exotoxin translocation efficiency. The delivery of T3SS toxins was investigated using a CCF2/β-lactamase fluorescent reporter system In parallel, the association of translocon proteins with host plasma membranes was evaluated by immunodetection of PopB/D following sucrose gradient fractionation of membranes. Promyelocytic HL-60 cells and promonocytic U937 cells were found to be resistant to toxin injection even though PopB/D associated with host cell plasma membranes. Differentiation of these cells to neutrophil- or macrophage-like cells resulted in an injection-sensitive phenotype without any significant change in the level of membrane-inserted translocon proteins. Treatment of sensitive HL-60 cells with a cholesterol-depleting agent, resulted in a diminished injection of toxin. Moreover, the PopB translocator was found in the membrane fraction obtained from sucrose-gradient purifications and containing lipid-raft marker flotillin. Through a pharmacological approach, we brought evidence that, in addition to membrane composition, some general signalling pathways involved in actin polymerization may be critical for the formation of a functional pore.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2011GRENV071 |
| Date | 20 December 2011 |
| Creators | Verove, Julien |
| Contributors | Grenoble, Rabiet, Marie-Josèphe, Cretin, François |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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