Salmonella no tifoidea, uno de los patógenos zoonóticos de mayor impacto, causa brotes en humanos debido al consumo de alimentos contaminados, siendo las aves de corral su principal reservorio. A raíz de la prohibición del uso de antibióticos como promotores del crecimiento en producción animal, se han aplicado diferentes medidas, como el uso de vacunas, probióticos, prebióticos y simbióticos, para el control de Salmonella en aves con una eficacia todavía limitada. Por ello, se ha planteado el uso de la terapia fágica como un medio alternativo de control de Salmonella.
Nuestro grupo demostró previamente que la terapia fágica oral, basada en un cóctel compuesto por los fagos UAB_Phi20, UAB_Phi78 y UAB_Phi87, reduce eficientemente la colonización de Salmonella en un modelo de pollo de engorde libre de patógenos específicos. Para completar la caracterización de estos fagos, en el presente trabajo se ha determinado que el inicio de la replicación del DNA del fago UAB_Phi78 se produce a los 10 min de la infección de Salmonella, siendo este tiempo de 20 min para los otros dos fagos. Se detectó DNA en células de Salmonella infectadas con los fagos UAB_Phi20 y UAB_Phi78 durante 40 min. Este tiempo fue de más de 120 min para el fago UAB_Phi87. Los extremos del cromosoma del bacteriófago UAB_Phi20 son permutaciones cíclicas y su mecanismo de empaquetamiento es el de llenado de cabeza de los fagos del género tipo P22. En cambio, los fagos UAB_Phi78 y UAB_Phi87 presentaron repeticiones terminales directas cortas en los extremos de sus cromosomas similares a las de los fagos de los géneros tipo SP6 (UAB_Phi78) y tipo FelixO1 (UAB_Phi87), respectivamente. Ninguno de los fagos fue capaz de promover transducción en las condiciones de ensayo utilizadas.
Los retos inherentes a la terapia fágica oral están relacionados con la falta de estabilidad del fago en el estómago y su reducido período de residencia en el tracto gastrointestinal. En este trabajo se han desarrollado dos métodos de encapsulación de bacteriófagos (liposomas y alginato-CaCO3) y se ha estudiado si la terapia fágica con fagos encapsulados supera los inconvenientes indicados. Para este estudio, se ha desarrollado un modelo animal de experimentación (pollos de engorde/Salmonella) que mimetiza las condiciones de las granjas de producción. La encapsulación en lípidos catiónicos permitió obtener fagos encapsulados con un diámetro de 308,6 a 325,8 nm, una carga positiva entre 31,6 y 35,1 mV (pH 6,1) y una eficiencia de encapsulación cercana al 50%. El diámetro medio de los fagos encapsulados en alginato-CaCO3 varió entre 123,7 y 149,3 µm, con eficiencias de encapsulación superiores al 90%. Además, ambas formulaciones son estables a 4oC como mínimo 6 meses. En fluido gástrico simulado (pH2,8), el título de los fagos sin encapsular disminuyó entre 5,7 y 8 log10 tras 60 min, mientras que el de los fagos encapsulados en liposomas y alginato-CaCO3 sólo disminuyó entre 3,7 y 5,4 log10 y ≤3,5 log10, respectivamente. Los fagos encapsulados en liposomas o alginato-CaCO3 se detectaron, respectivamente, en el 38,1% y el 71,4% de los animales a las 72 h y sólo en un 9,5% de los animales tratados con fagos no encapsulados. Además, el contenido cecal y el fluido intestinal simulado promueven la liberación de los fagos de las cápsulas lipídicas y de alginato-CaCO3, respectivamente. Finalmente, en experimentos de terapia fágica, la disminución de la concentración de Salmonella se prolongó como mínimo 7 días más en los animales tratados con fagos encapsulados que en los tratados con fagos no encapsulados tras la interrupción del tratamiento.
La metodología utilizada permite la encapsulación de bacteriófagos de diferentes morfologías en liposomas y alginato-CaCO3 y muestra que la encapsulación mejora significativamente la terapia fágica oral. / Non-typhoidal Salmonella, one of the most common zoonotic pathogens, causes foodborne disease outbreaks in humans. Poultry is the major reservoir of this bacterium. Following the ban on the use of antibiotics as growth promoters in animal production, Salmonella infection in poultry has been mainly controlled through biosafety measures implemented in animal production facilities and through the use of vaccines, probiotics, prebiotics, and synbiotics. Although reduction in the prevalence of several Salmonella serovars was achieved between 2007 and 2012 in the European Union, these methods are insufficient such that phage therapy has gained increasing attention for Salmonella control. In previous work, we demonstrated that oral phage therapy using a cocktail containing three bacteriophages (UAB_Phi20, UAB_Phi78, and UAB_Phi87) very efficiently reduces Salmonella colonization in specific pathogen free chickens. To better understand the efficacy and safety of these phages, we characterized their replication kinetics, genome ends, and transduction capability. The results showed that DNA replication was initiated 10 min after bacterial infection by UAB_Phi78 and 20 min after infection by UAB_Phi20 and UAB_Phi87. UAB_Phi20 and UAB_Phi78 DNA was detected inside the cells for 40 min and that of UAB_Phi87 for >120 min. The genome ends of the three phages differed and were included in specific DNA packaging strategies: P22likevirus headful (UAB_Phi20), SP6likevirus direct terminal repeats (UAB_Phi78), and Felixounalikevirus direct terminal repeats (UAB_Phi87). None was able to promote transduction under the conditions of the assay used.
The inherent challenges to the oral administration of bacteriophages as therapeutic agents against intestinal pathogens are related to the lack of phage stability in the stomach and the short residence time in the intestinal tract, which together lower the efficiency of phage therapy. In this work, two methods for phage encapsulation have been developed. The advantages of phage therapy with the encapsulated phages has been studied in an animal model (broiler/Salmonella) developed in this work that mimics the conditions of the farms. Encapsulation in cationic lipids yielded liposome-encapsulated phages with a mean diameter of 308.6 - 325.8 nm, a positive charge between +31.6 and +35.1 mV (pH 6.1), and an encapsulation efficiency yield of ~50%. In comparison, the mean diameter of the alginate-encapsulated phages ranged from 123.7 to 149.3 μm and the encapsulation efficiencies were >90%. The two phage formulations are stable for ≥6 months when stored at 4°C. The titre of non-encapsulated phages in simulated gastric fluid (pH 2.8) decreased by 5.7–8.0 log10 after 60 min, whereas liposome- and alginate-encapsulated phages were significantly more stable, with losses of 3.7–5.4 log10 units and ≤3.5 log10, respectively. Liposome and alginate-CaCO3 encapsulations also significantly improved bacteriophage retention in the chicken intestinal tract compared to the non-encapsulated preparations. In broilers administered cocktails of encapsulated and non-encapsulated phages, the former were detected in 38.1% (liposome) and 71.4% (alginate-CaCO3) of the animals after 72 h whereas the non-encapsulated phages were present in only 9.5%. In in vitro experiments, phage release from the liposomes and alginate-CaCO3 capsules was triggered by the caecal contents of broilers and simulated intestinal fluid, respectively. In commercial broilers experimentally infected with Salmonella, daily administration of the three cocktails for 7 days post-infection conferred similar levels of protection against Salmonella colonization. Although protection by the non-encapsulated phages disappeared once treatment was stopped, the decrease of the Salmonella concentration provided by both encapsulated forms persisted for at least another week, thus showing the enhanced efficacy of encapsulated phages in phage therapy. The work describes the methodology used to obtain liposome and alginate-CaCO3 phage encapsulation, which can be used with bacteriophages of different morphologies, and the advantages of both forms in overcoming the inherent drawbacks of orally administered phage therapy.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/368210 |
| Date | 05 February 2016 |
| Creators | Colom Comas, Joan |
| Contributors | Llagostera Casas, Montserrat, Cortés Garmendia, María Pilar, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Genètica i de Microbiologia |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 184 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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