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Previous issue date: 2003-03-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A dengue é uma doença febril, exantemática aguda considerada a mais importante arbovirose que afeta o homem. O diagnóstico laboratorial da dengue é realizado após suspeita clínica e as técnicas imunoenzimáticas, principalmente ELISA, são as mais difundidas, detectando anticorpos das classes IgM e IgG. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma técnica de hemaglutinação passiva de fácil execução, rápida e eficiente na detecção de anticorpos antidengue em sangue humano total. As próprias hemácias do paciente foram utilizadas como antígeno figurado, sendo o anti- soro contra hemácias humanas produzido em coelhos e purificado por precipitação e cromatografia. As imunoglobulinas G obtidas foram digeridas com o uso de papaína para a obtenção de fragmentos Fab. Após a separação, os fragmentos foram ligados às partículas virais de dengue, previamente purificadas em gradiente de densidade contínuo de tartarato de sódio e potássio, utilizando o glutaraldeído como agente acoplador. Demonstrou-se que a estratégia de conjugação dos fragmentos Fab à partícula viral é factível com uso de glutaraldeído, contudo, há necessidade do desenvolvimento de estudos para a verificação do grau de eficiência de conjugação. O método de conjugação adotado não impediu os fragmentos Fabs de se ligarem às hemácias e nem os anticorpos antidengue de reconhecerem seus epítopos na partícula viral. A utilização de anticorpos monoclonais, ou sistemas de expressão para proteínas virais assim como para fragmentos de anticorpos facilitariam as etapas de montagem do conjugado, além de otimizar o funcionamento da técnica. Em conclusão, a detecção de anticorpos antidengue em amostras de soro e hemácias foi possível a partir do método proposto. / Dengue is an acute febrile illness considered the most important arthropod-borne viral disease affecting humans. Currently most laboratory diagnoses of dengue are made after some clinical observations and use of immunoenzimatic techniques, notably ELISA can reliably detect small amounts of IgM and IgG classes of antibodies and have deserved worldwide acceptance. However, ELISA is a somewhat laborious, time-consuming technique and requires a expensive equipment. The present work was carried out to develop a feasible, inexpensive, quick and efficient passive hemaglutination technique for detection of anti-dengue antibodies in human whole blood, using the patient's blood cells as figured antigen. Antiserum against human erythrocytes was produced in rabbits and the IgG was purified by precipitation and chromatographic methods. IgG was then fractioned by papain digestion to yield Fab fragments. After separation, these fragments were linked by glutaraldehyde to the dengue viral particles successfully purified following a protocol which included centrifugation through a sodium and potassium tartarate density- gradient. However, the glutaraldehyde-mediated step need further work to establish an efficient degree of conjugation. The method did not alter either the Fab binding to erythrocytes or the recognition of viral epitopes by anti-dengue antibodies. Possibly, the use of monoclonal antibodies or a suitable system for protein expression could improve the conjugation step and help to optimize the routine testing of samples. In conclusion, a simple technique has been demonstrated to be suitable for detection of anti-dengue antibodies in samples of human blood or erythrocytes plus serum.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/10653 |
| Date | 13 March 2003 |
| Creators | Henriques, Dyana Alves |
| Contributors | Moraes, Célia Alencar de, Borges, Arnaldo Chaer, Mezencio, Jose Mario da Silveira |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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