As peroxirredoxinas constituem uma família de tiol-proteínas, que reduzem peróxido de hidrogênio, peróxidos orgânicos e peroxinitrito a água, álcool e nitrito, respectivamente, utilizando equivalentes redutores fornecidos pela tiorredoxina, tiorredoxina redutase e NADPH. As peroxirredoxinas são enzimas abundantes (constituem aproximadamente 0,7 % do total de proteínas solúveis presentes em leveduras) e foram identificadas em diversas espécies de animais, plantas e bactérias, porém seu papel fisiológico ainda é discutido. Até recentemente, as peroxirredoxinas eram consideradas pouco eficientes para detoxificar peróxidos, em comparação às catalases e heme-peroxidases. De fato, as constantes de segunda ordem determinadas para as reações de peroxirredoxinas com peróxido de hidrogênio eram da ordem de 104-105 M-1 s-1, valores muito menores que os de hemeproteínas (~107 M-1 s-1). Neste trabalho, um método de cinética competitiva foi desenvolvido para re-determinar essas constantes de velocidade, utilizando a peroxidase de raiz forte como competidora das peroxirredoxinas de S. cerevisiae, Tsa1 e Tsa2. Este método foi validado e as constantes de velocidade determinadas para Tsa1 e Tsa2 foram da ordem de k~ 107 M-1 s-1 para a reação com peróxido de hidrogênio e da ordem de k~10105 M-1 s-1 para a reação com peroxinitrito. Utilizando a mesma metodologia, foi possível ainda determinar o pKa da cisteína peroxidásica da Tsa1 e Tsa2 (Cys47), como sendo 5,4 e 6,3, respectivamente. Paralelamente, o papel fisiológico das peroxirredoxinas foi examinado em linhagens de S. cerevisiae com deleção de Tsa1, Tsa2 ou de ambas isoformas. Os estudos foram realizados sob condições fermentativas e a linhagem tsa1Δtsa2Δ se mostrou mais resistente ao peróxido de hidrogênio (1 mM) e o consumiu mais rapidamente que a WT. Além disso, a linhagem tsa1Δtsa2Δ produziu quantidades mais altas do radical 1-hidroxietila, produto da oxidação do etanol, que é o principal metabólito da levedura em anaerobiose. O mecanismo de formação do radical 1-hidroxietila foi examinado e a quantificação da concentração de ferro quelatável, ferro total e cobre mostrou que a reação de Fenton não era sua principal fonte. Outro mecanismo investigado foi a formação do radical através da atividade peroxidásica da Sod1, cuja expressão e atividade se mostraram aumentadas cerca de 5 e 2 vezes, respectivamente, na linhagem tsa1Δtsa2Δ. Na linhagem mutante ainda foi observado que o tratamento com peróxido de hidrogênio aumentou a concentração de radicais derivados e adutos do DNA, detectados por imuno-spin trapping e incorporação de 14C derivado da glicose. Em conjunto, os resultados deste trabalho reforçam a importância das peroxirredoxinas na defesa antioxidante e mostram que as respostas compensatórias empregadas pela levedura para contornar as deleções de Tsa1 e Tsa2 podem ser deletérias longo prazo. / Peroxiredoxins constitute a family of cysteine-based peroxidases that are able to reduce hydrogen peroxide, organic peroxides and peroxinitrite to water, alcohol and nitrite, respectively, through the use of reducing equivalents provided by thioredoxin, thioredoxin reductase and NADPH. Peroxiredoxins are abundant enzymes (correspond to approximately 0.7% of total soluble protein in yeasts) and have been identified in several species ranging from animals, plants and bacteria, but their physiological role remains under scrutiny. Peoxiredoxins were regarded as less eficient enzymes in comparison with catalases and heme-peroxidases for detoxification of peroxides. Second-order rate constants determined for the reaction of peroxiredoxins with hydrogen peroxide were in the range of 104-105 M-1 s-1, which is quite low, as compared with those of heme-proteins (~107 M-1 s-1). In the present work, a competitive kinetic approach with horseradish peroxidase was developed in order to determine the second order rate constant of the reaction of peroxiredoxins with peroxynitrite and hydrogen peroxide. This method was validated and permitted for the determination of the second order rate constant value of the reaction of Tsa1 and Tsa2 with peroxynitrite (k~105 M-1 s-1) and hydrogen peroxide (k~ 107 M-1 s-1) at pH 7.4, 25 °C. It also permitted the determination of the pKa of the peroxidatic cysteine of Tsa1 and Tsa2 (Cys47) as 5.4 and 6.3, respectively. In parallel, the physiological role of peroxiredoxins was examined in S. cerevisiae strains with deletion of Tsa1, Tsa2 or of both isoforms. Under fermentative conditions, tsa1Δtsa2Δ cells were more resistant to 1 mM hydrogen peroxide than WT cells, and consumed it faster. In addition, tsa1tsa2 cells produced higher yields of the 1- hydroxyethyl radical from the oxidation of the glucose metabolite ethanol, as shown by spintrapping experiments. A major role for Fenton chemistry in radical formation was excluded by comparing WT and tsa1Δtsa2Δ cells with respect to their levels of chelatable iron ions, total iron and copper ions, and of 1-hydroxyethyl radical produced in the presence of metal ion chelators. The main route for 1-hydroxyethyl radical formation was ascribed to the peroxidase activity of Sod1, whose expression and activity increased about five- and twofold, respectively, in tsa1Δtsa2Δ compared to WT cells. Relevantly, tsa1Δtsa2Δ cells challenged with hydrogen peroxide contained higher levels of DNA-derived radicals and adducts as monitored by immuno-spin trapping and incorporation of 14C from glucose into DNA, respectively. Taken together, our results reinforce the importance of peroxiredoxins in the antioxidant defense show that the compensatory responses employed by yeast to counterbalance the deletions of Tsa1 and Tsa2 may be deleterious in the long time range.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-25062009-143107 |
| Date | 12 March 2009 |
| Creators | Renata Ogusucu |
| Contributors | Ohara Augusto, Marilene Demasi, Alicia Juliana Kowaltowski, Sandro Roberto Marana, Carlos Frederico Martins Menck |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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