Diferentes métodos de caracterização e inferências filogenéticas baseadas na seqüência de alguns genes nucleares indicam que Typanosoma cruzi pode ser dividido em dois grupos principais, denominados T. cruzi I e T. cruzi II. Outros subgrupos de isolados foram descritos, tais como grupo de rDNA 1/2 e zimodema 3 (Z3) cuja relação filogenética com os grupos T.cruzi I e T.cruzi II ainda não está clara. O cariótipo molecular é uma ferramenta que permite abordar diferentes aspectos do genoma de organismos. Neste trabalho, caracterizamos o cariótipo molecular de 22 isolados de T. cruzi a partir da separação de seus cromossomos por eletroforese de campo pulsado e hibridação com sondas que representam genes codificadores de proteína e de RNA. Verificamos extenso polimorfismo cromossômico entre os isolados e que isolados pertencentes aos grupos T. cruzi II, rDNA 1/2 e Z3 têm cromossomos de tamanho molecular maior (até 3,5 Mb) em relação a isolados de T. cruzi I (até 2,8 Mb). Os dados do cariótipo molecular também foram utilizados para averiguar o significado evolutivo do polimorfismo cromossômico. As análises fenéticas foram baseadas no índice de diferença absoluta de tamanho cromossômico (aCSDI) obtido a partir da hibridação dos cromossomos com um número variável de marcadores genéticos. Inicialmente analisamos nove isolados, classificados por diferentes abordagens moleculares nos gruposT. cruzi I, T. cruzi II e grupo de rDNA 1/2, este último considerado um grupo de isolados híbridos e incluído por alguns autores no grupo T. cruzi II. Dendrogramas de aCSDI obtidos a partir de 3 a 21 sondas definiram em todos os casos três grupos: dois correspondentes a T. cruzi I e T. cruzi II e um terceiro, ao grupo de rDNA 1/2. O isolado CL Brener - organismo de referência do Projeto Genoma deT. cruzi - ora agrupou com T. cruzi II ora com o grupo de rDNA 1/2, ilustrando seu caráter híbrido. Três grupos também foram observados no dendrograma construído com dados de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP) hibridados com dezoito sondas. A topologia dos dendrogramas de dados de cariótipo molecular e de RFLP é similar, com um coeficiente de correlação significante (r = 0.86062; P < 0.0001), corroborando uma forte estruturação dos grupos. Subseqüentemente, avaliamos a posição de isolados de Z3 em relação aos três grupos acima mencionados, uma vez que alguns autores situam Z3 no grupo T. cruzi II. Analisamos o padrão de hibridação de 9 sondas com os cromossomos de 19 isolados (oito de Z3, três de T. cruzi I, três de T. cruzi II e cinco de rDNA 1/2). A topologia dos dendrogramas mostrou quatro grupos correspondentes, respectivamente, a T. cruzi I, T. cruzi II, grupo de rDNA 1/2 + CL Brener e Z3 (oito dos nove isolados). Este estudo também revelou que isolados híbridos têm uma maior proporção de cromossomos homólogos de tamanhos diferentes em comparação com isolados não híbridos. De um modo geral, nossos resultados mostram que cromossomos são caracteres valiosos para a identificação de táxons em T. cruzi. Uma vez que isolados do grupo de rDNA 1/2 apresentam cistrons ribossômicos de tipo 1 e de tipo 2, caracterizamos a distribuição dos cistrons nas bandas cromossômicas destes isolados. Verificamos que a fração majoritária dos genes de rDNA do tipo 2 está localizada na banda de 1,5 Mb e que os cistrons do tipo 1 estão localizados principalmente na banda de 1,1 Mb. Também estimamos o número de cromossomos e tamanho do genoma de quatro isolados de T. cruzi , com base na análise densitométrica da intensidade de fluorescência dos cromossomos corados com SYBR Green I. Para esta finalidade idealizamos um modelo matemático que permitiu estimar 52, 65, 72 e 44 cromossomos (na célula 2N), respectivamente, para CL Brener, Esmeraldo cl3, SO3 cl5 e Silvio X10 cl1. O tamanho do genoma dos isolados foi calculado, respectivamente em, 70 Mb, 78 Mb, 94,7 Mb e 47 Mb. Os novos aspectos do cariótipo molecular de T. cruzi aqui apresentados contribuirão para a compreensão da organização do genoma deste parasita e auxiliarão na atribuição de arcabouços de genes (scaffolds) aos cromossomos de CL Brener. / Different typing methods and phylogenetic inference based on the nucleotide sequence of few nuclear genes indicate that Trypanosoma cruzi can be divided into two major groups named as T. cruzi I and T. cruzi II. Additional subgroups of isolates have been described, such as group of rDNA 1/2 and zymodeme 3 (Z3), whose phylogenetic relationships with the T. cruzi I and T. cruzi II groups is not clear. The molecular karyotype is a tool that allows investigation of particular aspects of the genome of organisms. In this study, we have characterized the molecular karyotype of 22 isolates following the separation of chromosomes by pulsed-field gel electrophoresis and hybridization with probes that represent genes coding for proteins or RNA species. We observed an extensive chromosome polymorphism between the isolates and that isolates typed as T. cruzi II, rDNA 1/2 and Z3 have chromosome of larger molecular size (up to 3.5 Mb) in relation to T. cruzi I isolates (up to 2.8 Mb). Data from molecular karyotype have been also used to verify the evolutionary meaning of chromosome polymorphism. The phenetic analyses were based on the absolute chromosomal size difference index (aCSDI), calculated from the hybridization of a variable number of genetic markers. Initially, we analyzed nine isolates, classified by different molecular approaches into T. cruzi I,T. cruzi II and rDNA 1/2 groups. This latter group has been considered of hybrid genotypes and has been included by some authors in the T. cruzi II group. aCSDI-based dendrograms obtained from 3 to 21 probes defined in all the cases three clusters: two corresponding, respectively, to T. cruzi I and T. cruzi II groups; and a third one, to rDNA group 1/2. CL Brener - the reference organism of the T. cruzi Genome Project - was alternatively positioned in T. cruzi II or rDNA 1/2 group clusters, illustrating the hybrid nature of this isolate. Three clusters were also observed in the dendrogram constructed with restriction fragment length polymorphism (RFLP) data from 18 probes. The topology of the chromosome and RFLP dendrograms is similar, with a significant correlation coefficient (r = 0.86062; P < 0.0001), supporting a strong structuring of the clusters. Subsequently we evaluated the position of Z3 isolates in relation to the above-mentioned groups, because some authors clustered Z3 with T. cruzi II group. For this purpose we determined the hybridization pattern of 9 probes with the chromosomes of 19 isolates (eight of Z3; three of T. cruzi I; three of T. cruzi II and five of rDNA 1/2). The topology of the aCSDI-based dendrograms showed four clusters corresponding, respectively, to T. cruzi I, T. cruzi II, rDNA 1/2 + CL Brener and Zymodeme 3 (eight out of nine isolates). This study also revealed that hybrid stocks have a larger proportion of two different-sized homologous chromosomes, as compared with non-hybrid. Overall, our results show that chromosomes are valuable characters for identification of evolutionary groups in T. cruzi. Because rDNA 1/2 isolates have ribosomal cistrons of type 1 and type 2, we have characterized the distribution of both cistrons in the chromosomal bands of these isolates. We verified that the majority of type-2 rDNA genes are localized in a 1.5 Mb band, whereas type-1 cistrons are mostly concentrated in a 1.1 Mb band. We have also estimated the number of chromosomes and genome size of four T. cruzi isolates, based on the densitometric analysis of the fluorescence intensity of chromosomes stained with SYBR Green I. For this purpose, we devised a mathematical model that allowed estimating 52, 65, 72 and 44 chromosomes (2N cell), respectively, in CL Brener, Esmeraldo cl3, SO3 cl5 and Silvio X10 cl1. The genome size in these isolates has been calculated, respectively, as 70 Mb, 78 Mb, 94,7 Mb and 47 Mb. The novel aspects of T. cruzi karyotype here presented contribute to the comprehension of the genome organization of this parasite and will assist the assignment of scaffold to the CL Brener chromosomes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18102006-152129 |
| Date | 20 January 2005 |
| Creators | Pedroso Junior, Aurelio |
| Contributors | Zingales, Bianca Silvana |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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