O aumento da incidência da doença huanglonbing (HLB) nos pomares brasileiros tem contribuído significativamente para o aumento do custo de produção de laranja no Brasil, devido à suscetibilidade de todas as variedades cultivadas. O HLB é associado às bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus, transmitidas pelos psilídeos Diaphorina citri e Trioza erytreae. No Brasil, o inseto vetor responsável pela rápida disseminação da doença é o psilídeo Diaphorina citri. Os principais métodos de controle do HLB são a eliminação de plantas sintomáticas, uso de mudas sadias e controle do vetor. O uso de plantas geneticamente modificadas pode ser uma alternativa ao uso excessivo de inseticidas para controle do inseto vetor. Sendo assim, pode-se adotar uma nova tecnologia que se baseia no uso de RNAs de interferência (RNAi) para o silenciamento de genes específicos do inseto vetor. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do silenciamento dos genes calreticulina (DcCRT), lacase (DcLAC) e Snf7 (DcSNF7) de Diaphorina citri por RNA de interferência via alimentação em folhas destacadas de Murraya paniculata que absorveram solução contendo dsRNA de silenciamento. A princípio, foi avaliada a expressão dos genes candidatos em diferentes estádios fenológicos dos insetos. Em seguida, foram realizados bioensaios de sobrevivência e silenciamento, com as doses 0, 5, 25 e 50µg de dsRNA. A sobrevivência dos insetos foi avaliada ao longo de 144 horas, enquanto que os insetos utilizados na análise de expressão gênica foram coletados 12, 24, 48, 72 e 96h após o início da alimentação. Para os genes DcCRT, relacionado à quelatização de íons cálcio, e DcLAC, relacionado à gelificação oxidativa do estilete, ambos envolvidos no processo alimentar do inseto, também foi observado o efeito das doses de dsRNA na quantidade de alimento ingerido, 120h após o início da alimentação. Além disso, também foi realizado bioensaio com dsRNA Cy3-labbled, para verificar a distribuição do dsRNA absorvido. A expressão dos genes candidatos, de modo geral, se manteve uniforme ao longo dos estádios de desenvolvimento dos insetos, exceto para o gene DcLAC que apresentou maior expressão em adultos recém emergidos do que nos demais estádios avaliados. Nos bioensaios com dsRNA de silenciamento, observou-se fenótipo letal apenas com o silenciamento do gene DcSnf7, 144 horas após o início da alimentação. Durante o período avaliado, foi constatada redução na expressão gênica apenas de DcCRT, após 12h de alimentação e DcLAC após 96h de alimentação com seus respectivos dsRNA de silenciamento. Além disso, a dose de 5µg de dsRNA foi suficiente para causar tal efeito de silenciamento gênico. No bioensaio para quantificação da alimentação, observou- se redução na excreção de aminoácidos nos insetos alimentados com 5µg de dsRNA, em ambos os genes candidatos (DcCRT e DcLAC) 120h após o início da alimentação. Adicionalmente, a análise de distribuição de dsRNA pela folha mostrou que há absorção do dsRNA pela folha destacada, permitindo a alimentação pelo inseto. Dessa forma, conclui-se que os genes estudados apresentam potencial para o controle do psilídeo Diaphorina citri, via silenciamento gênico por RNAi. / The increase in the incidence of huanglonbing disease (HLB) in Brazilian orchards has contributed to increase of orange production costs in Brazil, due to the susceptibility of all cultivated variety of orange. HLB is associated with the Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus and Candidatus Liberibacter americanus bacteria, transmitted by the psyllids Diaphorina citri and Trioza erytreae. In Brazil, the insect vector responsible for the rapid spread of the disease is Diaphorina citri. The most important methods of HLB control are the elimination of symptomatic plants, the use of healthy nursery trees, and vector control. The use of genetically modified plants may be an alternative to the excessive use of insecticides to control the insect vector. Therefore, a new technology based on using RNAs of interference (RNAi), for silencing specific genes of the insect vector can be used. Thus, the aim of this work was to evaluate the effect of silencing calreticulin (DcCRT), laccase (DcLAC) and Snf7 (DcSNF7) genes in Diaphorina citri by interference RNA through feeding in leaves of Murraya paniculata that absorbed a solution containing dsRNA of silencing. At first, the expression of the candidate genes in different phenological stages of the insects was evaluated. Survival and silencing bioassays were then performed at doses of 0, 5, 25 and 50 µg of dsRNA. Insect survival was evaluated over 144 hours, while the insects used in gene expression analysis were collected 12, 24, 48, 72 and 96 hours after feeding. For the DcCRT genes, associated to the calcium ion chelation, and DcLAC, related to the oxidative gelling of the stylet, both involved in the insect feed process, the effect of the doses of dsRNA on the amount of food ingested, 120h after the beginning of feeding was observed. In addition, a bioassay with Cy3-labbled dsRNA was also performed to verify the distribution of absorbed dsRNA. The expression of the candidate genes generally remained uniform throughout the stages of insect development, except for the DcLAC gene that showed greater expression in newly emerged adults than in the other evaluated stages. In the bioassays with dsRNA for gene silencing, a lethal phenotype was observed only with the silencing of the DcSnf7 gene, 144 hours after the beginning of feeding. During the evaluated period, there was a reduction in the gene expression only of DcCRT, after 12h of feed and DcLAC after 96h of feeding with their respective silencing dsRNA. Additionally, the dose of 5µg of dsRNA was enough to cause this gene silencing effect. In the bioassay for feeding quantification, a reduction in amino acid excretion was observed in insects fed with 5 µg of dsRNA, in both candidate genes (DcCRT and DcLAC) 120 h after the beginning of feeding. In addition, the analysis of dsRNA distribution by the leaf showed that there is absorption of the dsRNA by the detached leaf, allowing feeding by the insect. Thus, we conclude that the genes studied have potential for the control of the psyllid Diaphorina citri, through gene silencing mediated by RNAi.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-15082019-161448 |
| Date | 29 April 2019 |
| Creators | Mendonça, Jéssika Angelotti |
| Contributors | Mourao Filho, Francisco de Assis Alves |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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