A (Na+,K+)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é um componente essencial do sistema de regulação iônica e osmótica e de excreção ativa de NH4 +. Dessa forma, a caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase branquial de Clibanarius vittatus pode fornecer dados importantes para a compreensão dos mecanismos bioquímicos desses processos. Nesse sentido, foram realizados ensaios cinéticos com a fração microsomal obtida do tecido branquial de C. vittatus. Os dados obtidos revelaram a presença de um único pico com atividade ATPase. Os dados obtidos a partir da hidrólise do substrato ATP revelaram a presença de dois sítios, um de alta afinidade que apresenta interação sítio-sítio (nH=1,9; K0,5= 63,8 ± 2,9 nM e V= 19,1 ± 0,8 U/mg) e outro de baixa afinidade, com características Michaelianas (nH=1,0; KM= 44,1 ± 2,6 mM e VM= 123,5 ± 6,1 U/mg). Além disso, foi observada interação do tipo sítio-sítio (nH= 1,8) para estimulação dos íons magnésio (V= 132,0 ± 5,3 U/mg e K0,5= 0,36 ± 0,02 mM). Por outro lado, as interações dos íons sódio (K0,5= 7,4 ± 0,4 mM), potássio (K0,5= 1,51 ± 0,05 mM) e amônio (K0,5= 4,5 ± 0,2 mM) obedeceram a uma cinética Michaeliana. Os dados obtidos mostraram que em condições saturantes de íons potássio, a atividade enzimática aumenta de maneira concentração-dependente quando na presença de íons amônio (V= 290,8 ± 14,4 U/mg e KM= 2,9 ± 0,1 mM). A presença da ouabaína no meio reacional acarretou 66% de inibição (KI= 117,3 ± 3,5 mM), indicando a presença de outras ATPases. A atividade K+-fosfatase, medida usando o substrato sintético PNFF revelou a presença de um único sítio de hidrólise (V= 47,4 ± 1,9 U/mg e KM= 1,0 ± 0,04 mM) com características Michaelianas (nH= 1,1). Entretanto, para os íons Mg2+ (nH= 2,6 e K0,5= 0,6 ± 0,1 mM), K+ (nH= 1,4 e K0,5= 3,7 ± 0,1 mM) e NH4 + (nH= 1,9 e K0,5= 19,3 ± 0,7 mM) foram observadas interações sítio-sítio. Em conjunto, os resultados cinéticos obtidos para a (Na+,K+)-ATPase branquial de C. vittatus, reforçam a possibilidade de que essa enzima contribui eficientemente com o mecanismo adaptativo desencadeado em resposta à exposição a altas concentrações externas de amônia. É importante ressaltar que o presente trabalho representa o primeiro estudo de caracterização cinética da enzima (Na+,K+)- ATPase no ermitão C. vittatus, um animal inserido em um microambiente constituído pela concha. Finalmente, este trabalho agrega informações relevantes relacionadas ao grupo dos Decapoda, em relação ao papel da (Na+,K+)-ATPase nos processos metabólicos e de osmorregulação nos crustáceos. / (Na+,K+)-ATPase is an essential component of osmotic and iono-regulatory system of crustacean gill and plays a relevant role in NH4 + excretion. Thus, the kinetic characterization of Clibanarius vittatus gill microsomal (Na+,K+)-ATPase, can provide crucial data to the understanding of osmoregulating and excretion processes of these animals in different environments, especially the shell microenvironment. In this way, kinetic assays were performed with gill microsomal fraction. The results showed a single protein peak with ATPase activity. The results from ATP hydrolysis revealed the presence of two different sites. One of them is related to the high-affinity with site-site interaction (nH=1.9; K0.5= 63.8 ± 2.9 nM and V= 19.1 ± 0.8 U/mg) and the other shows low-affinity, obeying Michaelis-Menten kinetics (nH=1.0; KM= 44.1 ± 2.6 mM and VM= 123.5 ± 6.1 U/mg). Moreover, site-site interaction (nH= 1.8) was observed to the magnesium ions stimulation (V= 132.0 ± 5.3 U/mg and K0.5= 0.36 ± 0.02 mM). On the other hand, the stimulations of Na+ (K0.5= 7.4 ± 0.4 mM), K+ (K0.5= 1.51 ± 0.05 mM) and NH4 + (K0.5= 4.5 ± 0.2 mM), followed Michaelis-Menten kinetics. At saturating concentrations of potassium ions, the enzyme activity was increased in a dependent-concentration manner with increasing ammonium ions concentration (V= 290.8 ± 14.4 U/mg and KM= 2.9 ± 0.1 mM). Ouabain inhibited 66% of (Na+,K+)-ATPase activity (KI= 117.3 ± 3.5 mM) of the gill microsomal enzyme, indicating the presence of other ATPase activities. The K+-fosfatase activity was also measured using PNPP, a synthetic substrate. PNPP hydrolysis resulted in single site hydrolysis site, obeying the Michaelis-Menten kinetics (nH= 1.1). However, it was observed site-site interactions for Mg2+ (nH= 2.6; K0.5= 0.6 ± 0.1 mM), K+ (nH= 1.4; K0.5= 3.7 ± 0.1 mM) and NH4 + (nH= 1.9; K0.5= 19.3 ± 0.7 mM) ion estimulations. Taken together, these results provide important informations on the kinetic properties of gill (Na+,K+)-ATPase of C. vittatus, emphasizing the synergiistic stimulation induced by K+ and NH4 +, which appear to contribute to the efficient adaptive mechanism triggered by exposure of high external ammonia concentrations. It is important to emphasize that this is the first study on the kinetic properties of (Na+,K+)-ATPase enzyme of the hermit crab C. vittatus. Finally, this study provide information concerning the (Na+,K+)-ATPase role in the metabolic and osmoregulating mechanisms of this Decapoda group
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-12052007-095301 |
| Date | 23 March 2007 |
| Creators | Sivieri, Rubia Regina Gonçalves |
| Contributors | Leone, Francisco de Assis |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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