Quimotripsinas (EC 3.4.21.1) são serina proteinases que possuem 245 resíduos de aminoácidos arranjados em dois domínios duplo β-barril, sendo que o sítio ativo está localizado entre esses dois domínios. O estudo da especificidade das endopeptidases foi facilitado pelo conceito de sítio de ligação do substrato, que corresponde ao sítio ativo daquelas enzimas. Porém, sobre as quimotripsinas de insetos, praticamente não existe informação a respeito da especificidade dos diferentes subsítios dessas enzimas. O estudo da especificidade dos subsítios das quimotripsinas dos insetos Periplaneta americana, Tenebrio molitor e Diatraea saccharalis apresentaram maior eficiência de hidrólise sobre substratos que apresentam um resíduo Tyr em P1, embora as razões Phe/Tyr para os diferentes insetos sejam bastante variadas. Estas diferenças indicam diferentes especificidades para as quimotripsinas de insetos em P1. No entanto, estas diferenças parecem não seguir a posição ocupada pelo inseto na escala evolutiva e são menos evidentes do que as verificadas para as tripsinas dos mesmos insetos, onde há troca de especificidade primária. A quimotripsina de Periplaneta americana como a de Diatraea saccharalis preferencialmente clivam substratos com Pro em P2. Porém, o mesmo não acontece com a quimotripsina de Tenebrio molitor, que apresentou maior kcat/Km para o peptídeo com Ala em P2, essa preferência pode estar relacionada à conformação da Pro que difere dos demais resíduos por ser um iminoácido. Porém, as três quimotripsinas estudadas apresentaram maior kcat/Km para o peptídeo Ile em P3 indicando que esse subsítio possui um papel fundamental na discriminação dessas enzimas por substratos com resíduos de aminoácidos específicos nessa posição. As quimotripsinas de Periplaneta americana e Diatraea saccharalis apresentaram maior kcat/Km pelo peptídeo com Ser em P1\', evidenciando que a presença de um grupo hidroxila na cadeia lateral da Ser e o baixo volume da cadeia lateral do resíduo, torna o subsítio dessas enzimas mais seletivo que a quimotripsina de Tenebrio molitor que apresentou maior kcat/Km pelo peptídeo com Ala. Dessa forma, esse estudo colabora para um melhor conhecimento da especificidade dos subsítios das endopeptidases digestivas de insetos pode dar diretrizes para a purificação ou síntese de inibidores mais eficazes com ação direta nas enzimas digestivas de insetos e serem utilizados na produção de plantas transgênicas ou utilizados como bioinseticidas. / Chymotrypsins (EC 3.4.21.1) are serine proteases with 245 amino acids disposed in two double ?-barrel domains, being the active site locate between these two domains. The specificity study of endopeptidases was facilitated by the substrate binding site concept that is the active site of these enzymes. However there is not much information about the subsites specificity of insect chymotrypsins. The specificity study of insects chymotrypsins subsites of Periplaneta americana, Tenebrio molitor and Diatraea saccharalis showed higher substrate hydrolysis efficiency with Tyr in P1, however the Phe/Tyr proportion for different insects are varied. These differences have shown different specificities for insect chymotrypsins in P1. Meanwhile, this difference does not follow the position occupied by insects in evolutive scale, and it is less clear than those showed by the same insect trypsins were there is primary specificity cross. Like Diatraea saccharalis, the Periplaneta americana chymotrypsin breaks the substrate with Pro in P2. Nevertheless the same does not happen to Tenebrio molitor chymotrypsin with the higher kcat/Km for the peptide with Ala in P2, this preference may be related to the different conformation of Pro. The three studied chymotrypsins showed higher kcat/Km for the peptide with Ile in P3, what indicates that this subsite has a key role on these enzymes discrimination for substrates with specific amino acids in this position. The Periplaneta americana and Diatraea saccharalis chymotrypsins presented higher kcat/Km for the peptide with Ser in P1` evidencing that the hydroxyl group side chain presence in Ser and low side chain volume made this subsite more selective than Tenebrio molitor chymotrypsin with higher kcat/Km by Ala peptide. This study collaborates to a best knowledge about the subsite specificities of the insect digestive endopeptidases and the best inhibitors for purification or synthesis with direct action in insect digestive enzymes and to be utilized for transgenic plants or bio-insecticides production.

Quimotripsinas (EC 3.4.21.1) são serina proteinases que possuem 245 resíduos de aminoácidos arranjados em dois domínios duplo β-barril, sendo que o sítio ativo está localizado entre esses dois domínios. O estudo da especificidade das endopeptidases foi facilitado pelo conceito de sítio de ligação do substrato, que corresponde ao sítio ativo daquelas enzimas. Porém, sobre as quimotripsinas de insetos, praticamente não existe informação a respeito da especificidade dos diferentes subsítios dessas enzimas. O estudo da especificidade dos subsítios das quimotripsinas dos insetos Periplaneta americana, Tenebrio molitor e Diatraea saccharalis apresentaram maior eficiência de hidrólise sobre substratos que apresentam um resíduo Tyr em P1, embora as razões Phe/Tyr para os diferentes insetos sejam bastante variadas. Estas diferenças indicam diferentes especificidades para as quimotripsinas de insetos em P1. No entanto, estas diferenças parecem não seguir a posição ocupada pelo inseto na escala evolutiva e são menos evidentes do que as verificadas para as tripsinas dos mesmos insetos, onde há troca de especificidade primária. A quimotripsina de Periplaneta americana como a de Diatraea saccharalis preferencialmente clivam substratos com Pro em P2. Porém, o mesmo não acontece com a quimotripsina de Tenebrio molitor, que apresentou maior kcat/Km para o peptídeo com Ala em P2, essa preferência pode estar relacionada à conformação da Pro que difere dos demais resíduos por ser um iminoácido. Porém, as três quimotripsinas estudadas apresentaram maior kcat/Km para o peptídeo Ile em P3 indicando que esse subsítio possui um papel fundamental na discriminação dessas enzimas por substratos com resíduos de aminoácidos específicos nessa posição. As quimotripsinas de Periplaneta americana e Diatraea saccharalis apresentaram maior kcat/Km pelo peptídeo com Ser em P1\', evidenciando que a presença de um grupo hidroxila na cadeia lateral da Ser e o baixo volume da cadeia lateral do resíduo, torna o subsítio dessas enzimas mais seletivo que a quimotripsina de Tenebrio molitor que apresentou maior kcat/Km pelo peptídeo com Ala. Dessa forma, esse estudo colabora para um melhor conhecimento da especificidade dos subsítios das endopeptidases digestivas de insetos pode dar diretrizes para a purificação ou síntese de inibidores mais eficazes com ação direta nas enzimas digestivas de insetos e serem utilizados na produção de plantas transgênicas ou utilizados como bioinseticidas. / Chymotrypsins (EC 3.4.21.1) are serine proteases with 245 amino acids disposed in two double ?-barrel domains, being the active site locate between these two domains. The specificity study of endopeptidases was facilitated by the substrate binding site concept that is the active site of these enzymes. However there is not much information about the subsites specificity of insect chymotrypsins. The specificity study of insects chymotrypsins subsites of Periplaneta americana, Tenebrio molitor and Diatraea saccharalis showed higher substrate hydrolysis efficiency with Tyr in P1, however the Phe/Tyr proportion for different insects are varied. These differences have shown different specificities for insect chymotrypsins in P1. Meanwhile, this difference does not follow the position occupied by insects in evolutive scale, and it is less clear than those showed by the same insect trypsins were there is primary specificity cross. Like Diatraea saccharalis, the Periplaneta americana chymotrypsin breaks the substrate with Pro in P2. Nevertheless the same does not happen to Tenebrio molitor chymotrypsin with the higher kcat/Km for the peptide with Ala in P2, this preference may be related to the different conformation of Pro. The three studied chymotrypsins showed higher kcat/Km for the peptide with Ile in P3, what indicates that this subsite has a key role on these enzymes discrimination for substrates with specific amino acids in this position. The Periplaneta americana and Diatraea saccharalis chymotrypsins presented higher kcat/Km for the peptide with Ser in P1` evidencing that the hydroxyl group side chain presence in Ser and low side chain volume made this subsite more selective than Tenebrio molitor chymotrypsin with higher kcat/Km by Ala peptide. This study collaborates to a best knowledge about the subsite specificities of the insect digestive endopeptidases and the best inhibitors for purification or synthesis with direct action in insect digestive enzymes and to be utilized for transgenic plants or bio-insecticides production.

A (Na+,K+)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é um componente essencial do sistema de regulação iônica e osmótica e de excreção ativa de NH4 +. Dessa forma, a caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase branquial de Clibanarius vittatus pode fornecer dados importantes para a compreensão dos mecanismos bioquímicos desses processos. Nesse sentido, foram realizados ensaios cinéticos com a fração microsomal obtida do tecido branquial de C. vittatus. Os dados obtidos revelaram a presença de um único pico com atividade ATPase. Os dados obtidos a partir da hidrólise do substrato ATP revelaram a presença de dois sítios, um de alta afinidade que apresenta interação sítio-sítio (nH=1,9; K0,5= 63,8 ± 2,9 nM e V= 19,1 ± 0,8 U/mg) e outro de baixa afinidade, com características Michaelianas (nH=1,0; KM= 44,1 ± 2,6 mM e VM= 123,5 ± 6,1 U/mg). Além disso, foi observada interação do tipo sítio-sítio (nH= 1,8) para estimulação dos íons magnésio (V= 132,0 ± 5,3 U/mg e K0,5= 0,36 ± 0,02 mM). Por outro lado, as interações dos íons sódio (K0,5= 7,4 ± 0,4 mM), potássio (K0,5= 1,51 ± 0,05 mM) e amônio (K0,5= 4,5 ± 0,2 mM) obedeceram a uma cinética Michaeliana. Os dados obtidos mostraram que em condições saturantes de íons potássio, a atividade enzimática aumenta de maneira concentração-dependente quando na presença de íons amônio (V= 290,8 ± 14,4 U/mg e KM= 2,9 ± 0,1 mM). A presença da ouabaína no meio reacional acarretou 66% de inibição (KI= 117,3 ± 3,5 mM), indicando a presença de outras ATPases. A atividade K+-fosfatase, medida usando o substrato sintético PNFF revelou a presença de um único sítio de hidrólise (V= 47,4 ± 1,9 U/mg e KM= 1,0 ± 0,04 mM) com características Michaelianas (nH= 1,1). Entretanto, para os íons Mg2+ (nH= 2,6 e K0,5= 0,6 ± 0,1 mM), K+ (nH= 1,4 e K0,5= 3,7 ± 0,1 mM) e NH4 + (nH= 1,9 e K0,5= 19,3 ± 0,7 mM) foram observadas interações sítio-sítio. Em conjunto, os resultados cinéticos obtidos para a (Na+,K+)-ATPase branquial de C. vittatus, reforçam a possibilidade de que essa enzima contribui eficientemente com o mecanismo adaptativo desencadeado em resposta à exposição a altas concentrações externas de amônia. É importante ressaltar que o presente trabalho representa o primeiro estudo de caracterização cinética da enzima (Na+,K+)- ATPase no ermitão C. vittatus, um animal inserido em um microambiente constituído pela concha. Finalmente, este trabalho agrega informações relevantes relacionadas ao grupo dos Decapoda, em relação ao papel da (Na+,K+)-ATPase nos processos metabólicos e de osmorregulação nos crustáceos. / (Na+,K+)-ATPase is an essential component of osmotic and iono-regulatory system of crustacean gill and plays a relevant role in NH4 + excretion. Thus, the kinetic characterization of Clibanarius vittatus gill microsomal (Na+,K+)-ATPase, can provide crucial data to the understanding of osmoregulating and excretion processes of these animals in different environments, especially the shell microenvironment. In this way, kinetic assays were performed with gill microsomal fraction. The results showed a single protein peak with ATPase activity. The results from ATP hydrolysis revealed the presence of two different sites. One of them is related to the high-affinity with site-site interaction (nH=1.9; K0.5= 63.8 ± 2.9 nM and V= 19.1 ± 0.8 U/mg) and the other shows low-affinity, obeying Michaelis-Menten kinetics (nH=1.0; KM= 44.1 ± 2.6 mM and VM= 123.5 ± 6.1 U/mg). Moreover, site-site interaction (nH= 1.8) was observed to the magnesium ions stimulation (V= 132.0 ± 5.3 U/mg and K0.5= 0.36 ± 0.02 mM). On the other hand, the stimulations of Na+ (K0.5= 7.4 ± 0.4 mM), K+ (K0.5= 1.51 ± 0.05 mM) and NH4 + (K0.5= 4.5 ± 0.2 mM), followed Michaelis-Menten kinetics. At saturating concentrations of potassium ions, the enzyme activity was increased in a dependent-concentration manner with increasing ammonium ions concentration (V= 290.8 ± 14.4 U/mg and KM= 2.9 ± 0.1 mM). Ouabain inhibited 66% of (Na+,K+)-ATPase activity (KI= 117.3 ± 3.5 mM) of the gill microsomal enzyme, indicating the presence of other ATPase activities. The K+-fosfatase activity was also measured using PNPP, a synthetic substrate. PNPP hydrolysis resulted in single site hydrolysis site, obeying the Michaelis-Menten kinetics (nH= 1.1). However, it was observed site-site interactions for Mg2+ (nH= 2.6; K0.5= 0.6 ± 0.1 mM), K+ (nH= 1.4; K0.5= 3.7 ± 0.1 mM) and NH4 + (nH= 1.9; K0.5= 19.3 ± 0.7 mM) ion estimulations. Taken together, these results provide important informations on the kinetic properties of gill (Na+,K+)-ATPase of C. vittatus, emphasizing the synergiistic stimulation induced by K+ and NH4 +, which appear to contribute to the efficient adaptive mechanism triggered by exposure of high external ammonia concentrations. It is important to emphasize that this is the first study on the kinetic properties of (Na+,K+)-ATPase enzyme of the hermit crab C. vittatus. Finally, this study provide information concerning the (Na+,K+)-ATPase role in the metabolic and osmoregulating mechanisms of this Decapoda group

A (Na+,K+)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é um componente essencial do sistema de regulação iônica e osmótica e de excreção ativa de NH4 +. Dessa forma, a caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase branquial de Clibanarius vittatus pode fornecer dados importantes para a compreensão dos mecanismos bioquímicos desses processos. Nesse sentido, foram realizados ensaios cinéticos com a fração microsomal obtida do tecido branquial de C. vittatus. Os dados obtidos revelaram a presença de um único pico com atividade ATPase. Os dados obtidos a partir da hidrólise do substrato ATP revelaram a presença de dois sítios, um de alta afinidade que apresenta interação sítio-sítio (nH=1,9; K0,5= 63,8 ± 2,9 nM e V= 19,1 ± 0,8 U/mg) e outro de baixa afinidade, com características Michaelianas (nH=1,0; KM= 44,1 ± 2,6 mM e VM= 123,5 ± 6,1 U/mg). Além disso, foi observada interação do tipo sítio-sítio (nH= 1,8) para estimulação dos íons magnésio (V= 132,0 ± 5,3 U/mg e K0,5= 0,36 ± 0,02 mM). Por outro lado, as interações dos íons sódio (K0,5= 7,4 ± 0,4 mM), potássio (K0,5= 1,51 ± 0,05 mM) e amônio (K0,5= 4,5 ± 0,2 mM) obedeceram a uma cinética Michaeliana. Os dados obtidos mostraram que em condições saturantes de íons potássio, a atividade enzimática aumenta de maneira concentração-dependente quando na presença de íons amônio (V= 290,8 ± 14,4 U/mg e KM= 2,9 ± 0,1 mM). A presença da ouabaína no meio reacional acarretou 66% de inibição (KI= 117,3 ± 3,5 mM), indicando a presença de outras ATPases. A atividade K+-fosfatase, medida usando o substrato sintético PNFF revelou a presença de um único sítio de hidrólise (V= 47,4 ± 1,9 U/mg e KM= 1,0 ± 0,04 mM) com características Michaelianas (nH= 1,1). Entretanto, para os íons Mg2+ (nH= 2,6 e K0,5= 0,6 ± 0,1 mM), K+ (nH= 1,4 e K0,5= 3,7 ± 0,1 mM) e NH4 + (nH= 1,9 e K0,5= 19,3 ± 0,7 mM) foram observadas interações sítio-sítio. Em conjunto, os resultados cinéticos obtidos para a (Na+,K+)-ATPase branquial de C. vittatus, reforçam a possibilidade de que essa enzima contribui eficientemente com o mecanismo adaptativo desencadeado em resposta à exposição a altas concentrações externas de amônia. É importante ressaltar que o presente trabalho representa o primeiro estudo de caracterização cinética da enzima (Na+,K+)- ATPase no ermitão C. vittatus, um animal inserido em um microambiente constituído pela concha. Finalmente, este trabalho agrega informações relevantes relacionadas ao grupo dos Decapoda, em relação ao papel da (Na+,K+)-ATPase nos processos metabólicos e de osmorregulação nos crustáceos. / (Na+,K+)-ATPase is an essential component of osmotic and iono-regulatory system of crustacean gill and plays a relevant role in NH4 + excretion. Thus, the kinetic characterization of Clibanarius vittatus gill microsomal (Na+,K+)-ATPase, can provide crucial data to the understanding of osmoregulating and excretion processes of these animals in different environments, especially the shell microenvironment. In this way, kinetic assays were performed with gill microsomal fraction. The results showed a single protein peak with ATPase activity. The results from ATP hydrolysis revealed the presence of two different sites. One of them is related to the high-affinity with site-site interaction (nH=1.9; K0.5= 63.8 ± 2.9 nM and V= 19.1 ± 0.8 U/mg) and the other shows low-affinity, obeying Michaelis-Menten kinetics (nH=1.0; KM= 44.1 ± 2.6 mM and VM= 123.5 ± 6.1 U/mg). Moreover, site-site interaction (nH= 1.8) was observed to the magnesium ions stimulation (V= 132.0 ± 5.3 U/mg and K0.5= 0.36 ± 0.02 mM). On the other hand, the stimulations of Na+ (K0.5= 7.4 ± 0.4 mM), K+ (K0.5= 1.51 ± 0.05 mM) and NH4 + (K0.5= 4.5 ± 0.2 mM), followed Michaelis-Menten kinetics. At saturating concentrations of potassium ions, the enzyme activity was increased in a dependent-concentration manner with increasing ammonium ions concentration (V= 290.8 ± 14.4 U/mg and KM= 2.9 ± 0.1 mM). Ouabain inhibited 66% of (Na+,K+)-ATPase activity (KI= 117.3 ± 3.5 mM) of the gill microsomal enzyme, indicating the presence of other ATPase activities. The K+-fosfatase activity was also measured using PNPP, a synthetic substrate. PNPP hydrolysis resulted in single site hydrolysis site, obeying the Michaelis-Menten kinetics (nH= 1.1). However, it was observed site-site interactions for Mg2+ (nH= 2.6; K0.5= 0.6 ± 0.1 mM), K+ (nH= 1.4; K0.5= 3.7 ± 0.1 mM) and NH4 + (nH= 1.9; K0.5= 19.3 ± 0.7 mM) ion estimulations. Taken together, these results provide important informations on the kinetic properties of gill (Na+,K+)-ATPase of C. vittatus, emphasizing the synergiistic stimulation induced by K+ and NH4 +, which appear to contribute to the efficient adaptive mechanism triggered by exposure of high external ammonia concentrations. It is important to emphasize that this is the first study on the kinetic properties of (Na+,K+)-ATPase enzyme of the hermit crab C. vittatus. Finally, this study provide information concerning the (Na+,K+)-ATPase role in the metabolic and osmoregulating mechanisms of this Decapoda group

Eventos como fosforilação e desfosforilação estão presentes nos processos de crescimento e diferenciação celular. As proteínas tirosina fosfatases estão envolvidas nestes processos. Estas enzimas são encontradas em animais, plantas e ocorrem em diversas formas, diferindo no peso molecular, substrato específico e sensibilidade a inibidores. As enzimas que possuem baixo peso molecular (entre 18-20 KDa), hidrolisam p-nitrofenilfosfato e são sensíveis ao p-hidroximercuribenzoato são chamadas como proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular relativo (PTP-BMr) ou fosfatases ácidas. Vários dados sugerem que tipos de células de osso, como osteoblastos, podem expressar esta enzima ativa. Aqui, culturas de osteoblastos derivadas da medula removida do fêmur de rato foram investigadas para padronizar a metodologia de obtenção da PTP-BMr. A expressão e atividade catalítica desta enzima em diferentes estágios de crescimento de osteoblastos também foram verificadas. Foi observado que são necessários de 16-19 dias de cultura para obter maiores níveis de atividade da PTP-BMr em extrato citoplasmático. O nível de expressão do gene da PTP-BMr foi determinado por PCR em tempo real e uma maior quantificação de RNAm foi obtida em 16 dias de crescimento de osteoblasto. A caracterização bioquímica parcial confirma uma banda de atividade em gel de poliacrilamida com peso molecular de 17,6 KDa, e pH ótimo de 5,5. A hidrólise do p-nitrofenilfosfato demonstra uma pequena cooperatividade relativa (n=1,2) com K0,5= 0,12 e Vmax= 3,5U/mg. Esta atividade foi fortemente inibida (60 a 75%) por molibdato de amônio (10mM); fosfato de sódio (10mM); ortovanadato de sódio (10mM) e p-hidroximercuribenzoato de sódio (10mM). Estas propriedades são típicas desta classe. A interação entre osteoblastos e diferentes superfícies pode ativar ou desativar genes. Este presente projeto investigou se a interação com superfície de titânio pode modificar o perfil de atividade da PTP-BMr. Quando em presença de uma superfície de titânio há um maior aumento na atividade catalítica do que nos níveis de RNAm da PTP-BMr o que sugere uma estimulação da enzima a qual pode estar auxiliando no processo de formação óssea. / Events as phosphorilation and desphosphorilation are experienced in cell growth and differentiation processes. Tyrosine phosphatases proteins are involved in these processes. These enzymes are found in animals, plants and occur in multiple forms, differing in relative molecular weight, substrate specificity and sensitivity to inhibitors. The enzymes that have low molecular weight (between 18-20KDa), hydrolize p-nitrophenilphosphate and are sensible to p-hidroximercuribenzoate are known as low molecular weight relative tyrosine phosphatase proteins (PTP-LMWr) or acid phosphatase. Several data suggest that bone cell types, such as osteoblasts, may express this enzyme activity. Here, osteosblast cultures derived from medulla removed from rat femur were investigated to standardize the methodology of PTP-LMW obtainment. The expression and the catalytic activity of this protein in different stages of osteoblast growth were checked as well. It was observed that 16-19 culture days are necessary to obtain greater levels of activity of PTP-LMW in the cytoplasmatic extracts. The gene expression level of PTP-LMW was determined by quantitative real-time PCR, and a greater quantity of mRNA was observed within sixteen days of osteoblast growth. The partial biochemistry characterization confirms a single active band in poliacrilamide gel with molecular weight of about 17.6KDa, and a pH-optimum around 5.5. p-nitrophenilphosphate hydrolysis shows a small cooperative behavior (n=1.2) with K0.5=0.12mM and Vmax=3.5U/mg. This activity was strongly inhibited (about 60-95%) by ammonium molybdate (10mM); sodium phosphate (10mM); sodium orthovanadate (10mM) and sodium p-hydroximercuribenzoate (10mM). These properties are typical for this enzyme class.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-18T13:30:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 411024 bytes, checksum: e18556a527e2d31b711910c0cee97868 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T13:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 411024 bytes, checksum: e18556a527e2d31b711910c0cee97868 (MD5) Previous issue date: 2001-12-07 / Lipoxigenases (EC: 1.13.11.12) são enzimas que catalisam a dioxigenação estereoespecífica de ácidos graxos poliinsaturados que contêm o sistema cis,cis-1,4-pentadieno, formando hidroperóxidos que são posteriormente metabolizados, produzindo substâncias fisiologicamente ativas. A Via das Lipoxigenases promove a formação de compostos orgânicos voláteis responsáveis pelo beany flavor dos grãos de soja, o que limita a utilização dessa oleaginosa na alimentação humana. Outra barreira que limita o consumo da oleaginosa na dieta humana são os inibidores de proteases (KTI) que constituem um dos principais fatores antinutricionais da soja. A Via das Lipoxigenases está ligada a importantes processos fisiológicos da planta, tais como: crescimento, desenvolvimento, senescência e na biossíntese de moléculas regulatórias. É postulado que os inibidores de proteases atuam no mecanismo de defesa de plantas contra infestação de insetos e patógenos. Uma estratégia para eliminação do beany flavor e dos fatores antinutricionais é a retirada, pela manipulação genética, das lipoxigenases e dos inibidores de proteases (KTI) dos grãos de soja, desde que essa manipulação genética não altere as funções das lipoxigenases e dos inibidores de proteases presentes nas folhas de soja, tendo em vista suas participações nos mecanismos de defesa da planta a insetos-praga e patógenos. Esse trabalho avaliou a capacidade da planta da soja de responder ao ataque da lagarta da soja ( Anticarsia gemmatalis Hübner) através da Via das Lipoxigenases. Foram utilizados quatro genótipos da variedade CAC-1, contrastando para ausência e presença de genes que codificam as lipoxigenases e os inibidores de proteases nas sementes. As plantas de soja foram submetidas ao ataque da lagarta da soja ( Anticarsia gemmatalis Hübner) e os folíolos da primeira folha trifoliolar de plantas tratadas foram coletados em 6, 12 e 24 horas na presença do inseto e em 6, 12, 24 e 48 horas na ausência do inseto, com os seus respectivos controles. Análises bioquímico-cinéticas mostraram dois picos mais acentuados de atividade e atividade específica de lipoxigenases a pH 4,5 e 6,5, com temperatura ótima de atividade e atividade específica a 25°C. Para os quatro genótipos, as atividades foram maiores nos tratamentos que nos respectivos controles. Os resultados de atividade específica sugerem que a planta de soja respondeu ao ataque da lagarta pelo aumento da atividade de lipoxigenases. Para os quatro genótipos, os valores de K Mapp determinados no pool de lipoxigenases de folhas de soja em 6, 12 e 24 horas, em presença do inseto, e em 6, 12, 24 e 48 horas, na ausência do inseto, foram menores do que os respectivos controles. Houve um aumento nos níveis de inibidores de proteases para os quatro genótipos. A produção de hexanal e de aldeídos totais foi menor 48 horas após a retirada do inseto, indicando que ocorreu resposta da planta de soja ao ataque da lagarta pela Via das Lipoxigenases. / The lipoxygenases patway is responsible for the forming of organic compounds responsible for the beany flavor in the soybean seeds, which limits the usage of the oleaginous in the human alimentation. Another barrier that limits the consumption of the oleaginous in the human diets is the inhibitors of proteases (KTI), which constitutes one of the main anti-nutritional factors of the soybeans. The lipoxygenases patway is connected to chief physiological processes of the plant, such as: growth, development, senescence and the biosynthesis of the regulatory molecules. It is postulated that the proteases inhibitors act in the plants defense mechanism against the infestation of insects and p athogens. A strategy in the elimination of the beany flavor and the anti-nutritional factors is the removal, through genetic manipulation, of the lipoxygenases and the inhibitors of proteases (KTI) from the soybean seeds, provided that this genetic manipulation does not meddle with the functions of the lipoxygenases and the inhibitors of proteases present in the soybeans leaves, having in mind its partaking in the defenses mechanism towards the attack of the soybean caterpillar ( Anticarsia gemmatalis Hübner) through means of the lipoxygenases pathway. Four genotypes of the variety CAC-1 were used, contrasting to the absence and presence of gene that codify the lipoxygenases and the inhibitors of proteases in the seeds. The soybean plants were yielded to the attack of the soybean caterpillar ( Anticarsia gemmatalis Hübner) and the follicles of the first trifoliate leaf of the assisted plants were collected in 6,12 and 24 hours in the presence of the insect and 6, 12, 24 and 48 hours in the absence of the insect, with their respective controls. Biochemical-kinetic analyses displayed two more accentuated acme of activity and specific lipoxygenases activity at pH 4,5 and 6,5, with optimum activity temperature and specific activity at 25°C, on the four genotypes, the activities were greater in the treatment than on the respective controls. The results for specific activity suggest that the soybean plant responded to the attack of the caterpillar through the increase of lipoxygenases activity. On the four genotypes, the rates of K Mapp determined in the pool of lipoxygenases of soybean leaves, in 6, 12 and 24 hours, in the presence of the insect were smaller then respective controls. There was na increase in the proteases inhibition levels on the four genotypes. The production of hexanal and total aldehydes was fewer 48 hours after the removal of the insect, indicating that there happened a response from the soybean plant towards the attack from the caterpillar, through means of the lipoxygenases patway.

Eventos como fosforilação e desfosforilação estão presentes nos processos de crescimento e diferenciação celular. As proteínas tirosina fosfatases estão envolvidas nestes processos. Estas enzimas são encontradas em animais, plantas e ocorrem em diversas formas, diferindo no peso molecular, substrato específico e sensibilidade a inibidores. As enzimas que possuem baixo peso molecular (entre 18-20 KDa), hidrolisam p-nitrofenilfosfato e são sensíveis ao p-hidroximercuribenzoato são chamadas como proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular relativo (PTP-BMr) ou fosfatases ácidas. Vários dados sugerem que tipos de células de osso, como osteoblastos, podem expressar esta enzima ativa. Aqui, culturas de osteoblastos derivadas da medula removida do fêmur de rato foram investigadas para padronizar a metodologia de obtenção da PTP-BMr. A expressão e atividade catalítica desta enzima em diferentes estágios de crescimento de osteoblastos também foram verificadas. Foi observado que são necessários de 16-19 dias de cultura para obter maiores níveis de atividade da PTP-BMr em extrato citoplasmático. O nível de expressão do gene da PTP-BMr foi determinado por PCR em tempo real e uma maior quantificação de RNAm foi obtida em 16 dias de crescimento de osteoblasto. A caracterização bioquímica parcial confirma uma banda de atividade em gel de poliacrilamida com peso molecular de 17,6 KDa, e pH ótimo de 5,5. A hidrólise do p-nitrofenilfosfato demonstra uma pequena cooperatividade relativa (n=1,2) com K0,5= 0,12 e Vmax= 3,5U/mg. Esta atividade foi fortemente inibida (60 a 75%) por molibdato de amônio (10mM); fosfato de sódio (10mM); ortovanadato de sódio (10mM) e p-hidroximercuribenzoato de sódio (10mM). Estas propriedades são típicas desta classe. A interação entre osteoblastos e diferentes superfícies pode ativar ou desativar genes. Este presente projeto investigou se a interação com superfície de titânio pode modificar o perfil de atividade da PTP-BMr. Quando em presença de uma superfície de titânio há um maior aumento na atividade catalítica do que nos níveis de RNAm da PTP-BMr o que sugere uma estimulação da enzima a qual pode estar auxiliando no processo de formação óssea. / Events as phosphorilation and desphosphorilation are experienced in cell growth and differentiation processes. Tyrosine phosphatases proteins are involved in these processes. These enzymes are found in animals, plants and occur in multiple forms, differing in relative molecular weight, substrate specificity and sensitivity to inhibitors. The enzymes that have low molecular weight (between 18-20KDa), hydrolize p-nitrophenilphosphate and are sensible to p-hidroximercuribenzoate are known as low molecular weight relative tyrosine phosphatase proteins (PTP-LMWr) or acid phosphatase. Several data suggest that bone cell types, such as osteoblasts, may express this enzyme activity. Here, osteosblast cultures derived from medulla removed from rat femur were investigated to standardize the methodology of PTP-LMW obtainment. The expression and the catalytic activity of this protein in different stages of osteoblast growth were checked as well. It was observed that 16-19 culture days are necessary to obtain greater levels of activity of PTP-LMW in the cytoplasmatic extracts. The gene expression level of PTP-LMW was determined by quantitative real-time PCR, and a greater quantity of mRNA was observed within sixteen days of osteoblast growth. The partial biochemistry characterization confirms a single active band in poliacrilamide gel with molecular weight of about 17.6KDa, and a pH-optimum around 5.5. p-nitrophenilphosphate hydrolysis shows a small cooperative behavior (n=1.2) with K0.5=0.12mM and Vmax=3.5U/mg. This activity was strongly inhibited (about 60-95%) by ammonium molybdate (10mM); sodium phosphate (10mM); sodium orthovanadate (10mM) and sodium p-hydroximercuribenzoate (10mM). These properties are typical for this enzyme class.

Made available in DSpace on 2017-07-20T12:40:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Agnes Thiane Machado.pdf: 7176772 bytes, checksum: 01a4049f5c4aed0935803a0cf3a6468d (MD5) Previous issue date: 2017-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Study of protein three-dimensional structures allow us to investigate the relations between amino acid sequence, structure and function, what is important chiefly for proteins from pathogenic organisms or ones that belong to the same genus of these, such that they can be used as a structural model. In this context, this work aims at the structural characterization of the enzymes alanine racemase long isoform from Trypanosoma cruzi and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Naegleria gruberi. The long isoform of alanine racemase catalyzes the conversion between L and D-alanine which, in turn, is part of one of the metabolic pathways in Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The heterologous expression of this enzyme in Escherichia coli BL21 (DE3) GroEL was analyzed by SDS-PAGE, which revealed that the protein is in higher proportion in the insoluble fraction, thus it was necessary to establish a recovery protocol followed by an in vitro refolding. Data from enzymatic assays and circular dichroism revealed the success of the recovery/refolding protocol, which may in the future contribute to the search for specific inhibitors. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Naegleria gruberi catalyzes the sixth step of the organism’s glycolytic pathway. NgGAPDH enzyme was expressed in E. coli (DE3) using the pET-15b vector, and then purified by tree chromatographic steps, two of nickel affinity and one of size exclusion. The enzymatic characterization was investigated with the enzyme without the his-tag; NgGAPDH presented higher activity at pH 8.0, 25 °C and 10 mM of arsenate, and positive cooperativity for substrates G3P and NAD+. His-tag depleted NgGAPDH crystals appeared in 3 days after drop settings, the best crystal diffracted to 1.94 A resolution and belongs to space group P21 with cell parameters a = 83.74 A, b = 94.55 A, c = 90.93 A, = 99.96 °. The final refined structure presents R = 0.1652 and Rfree = 0.2029. The catalytic domain formed by residues 134 to 313 is highly conserved, as expected, with the exception of Asn145, present only in NgGAPDH, while the other GAPDHs present either Ser or Thr on the corresponding position. Molecular dynamics analysis revealed that Asn145 has correlated motion with residues Ala123, Thr125 and Pro126 that belong to what was called "bonded loop". It should be emphasized that this is the first GAPDH from the phylum Percolozoa that has its three dimensional structure determined and kinetic parameters established, such that we expect to have contributed to the understanding of the evolution of this class of proteins. / O estudo da estrutura tridimensional de proteínas nos permite investigar as relações entre sequência de aminoácidos, estrutura e função, o que é importante principalmente para proteínas de organismos patogênicos ou mesmo pertencente ao gênero destes, que podem ser utilizadas como modelo estrutural. Neste contexto, o presente trabalho visa caracterizar estruturalmente as enzimas alanina racemase isoforma longa de Trypanosoma cruzi e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Naegleria gruberi. A alanina racemase isoforma longa catalisa a conversão entre L e D-alanina em uma das vias metabólicas do T. cruzi, que é o agente etiológico da doença de Chagas. A análise por SDS-PAGE de amostras da expressão heteróloga dessa enzima em Escherichia coli BL21(DE3) GroEL revelou que a proteína está em maior proporção na fração insolúvel, por isso, foi necessário estabelecer um protocolo de recuperação seguido de um reenovelamento in vitro. Dados de ensaios enzimáticos e dicroísmo circular revelaram o sucesso do protocolo de recuperação/reenovelamento, o que poderá no futuro contribuir para a busca de inibidores específicos. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Naegleria gruberi catalisa a sexta etapa da via glicolítica do organismo. A enzima NgGAPDH foi expressa em E. coli (DE3) usando-se o vetor pET-15b e então purificada em três passos de cromatografia, dois por afinidade a níquel e um por exclusão por tamanho. A caracterização enzimática foi realizada com a enzima sem a ―his-tag‖; a NgGAPDH apresentou maior atividade em pH 8,0, 25 °C e 10 mM de arsenato, e cooperatividade positiva frente aos substratos G3P e NAD+. Cristais de NgGAPDH sem a ―his-tag‖ apareceram em 3 dias após montagem das gotas e o melhor difratou a 1,94 A de resolução, pertencendo ao grupo espacial P21 com parâmetros de cela a = 83,74 Å, b = 94,55 A, c = 90,93 A e = 99,96 °. A estrutura final refinada apresenta R = 0,1652 e Rfree = 0,2029. O domínio catalítico formado pelos resíduos 134 a 313 é altamente conservado, como esperado, com exceção da Asn145, presente somente em NgGAPDH, enquanto que as demais GAPDHs apresentam Ser ou Thr na posição correspondente. Análises por dinâmica molecular revelaram que a Asn145 tem correlação de movimento com os resíduos Ala123, Thr125 e Pro126, pertencentes ao que se chamou de ―bonded loop‖. Ressalte-se que esta é a primeira GAPDH do filo Percolozoa que tem sua estrutura tridimensional determinada e parâmetros cinéticos estabelecidos, tal que se espera contribuir para o entendimento da evolução dessa classe de proteínas.

Os estudos da função intestinal foram particularmente estimulados após a conscientização de que o tubo digestivo é uma enorme interface relativamente pouco protegida entre o inseto e o meio ambiente e pode ser usado como alvo para controle de pragas. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma α-manosidase solúvel e a detecção de uma α-manosidase de membrana. As α-manosidases pertencem a uma família de exoglicosidases as quais hidrolisam resíduos de α-D-manosil a partir de terminais não redutores de oligossacarídeos. Estas enzimas são implicadas no catabolismo de carboidratos e na via de N-glicosilação protéica em insetos, mas pouco se sabe sobre a bioquímica destas glicosidases. O Tenebrio molitor é um Coleoptera bastante estudado pelo nosso laboratório devido a sua relevância como praga agrícola e o seu posicionamento em um ponto estratégico da árvore filogenética de insetos. O estudo de distribuição desta enzima mostrou que a α-manosidase encontra-se, principalmente, como uma enzima solúvel no conteúdo anterior e médio do intestino médio, mas também existe uma atividade significante na fração de membrana. Para confirmar a existência desta enzima de membrana, microvilosidades foram purificadas por precipitação diferencial com cálcio. A enzima aminopeptidase foi utilizada como marcadora, uma vez que sabe-se que esta enzima é uma típica de membrana microvilar. Como a α-manosidase solúvel é majoritária demos início a sua purificação e posterior caracterização. A sua purificação foi realizada utilizando uma combinação de quatro passos de cromatografia: Uma de troca iônica em Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), duas filtrações em gel, uma em Superdex 75 e outra em Superdex 200 (Amersham/Bioscience) usando o sistema AKTA, e o último passo é uma hidrofóbica em Phenyl Superose. Nós observamos a presença de dois picos de atividade nomeados de Man 1 e Man 2, sugerindo a existência de duas α- manosidases solúveis, que se diferem quanto a hidrofobicidade. O pH ótimo das α-manosidases é de 5,6 e sua massa molecular, determinada por cromatografia de 8 filtração em gel, é de 123 kDa, e no SDS-PAGE observamos uma única banda de 70 KDa, indicando a existência de duas subunidades. Em um gel nativo revelado com o substrato fluorescente (metilumbelliferil-α-D-manopiranosídeo) nota-se somente uma banda de atividade. A Man 2 possui pI de 3,38. α-manosidases de T. molitor seguem a cinética de Michaelis-Menten com Km para o substrato p-nitrofenil-α-D-manopiranosídeo de 0,84 mM para Man 1 e 0,62 mM para Man 2. Também foram feitos ensaios de inibição com dois inibidores que sabidamente inibem carboidrases, um é o deoximanojirimicina e o outro é a swainsonina. O Ki encontrado para o primeiro inibidor foi de 0,12 mM para Man 1 e 0,15 mM para Man 2 e o Ki para o segundo inibidor foi de 67,8 nM para Man 1 e 63 nM para Man 2, sendo ambos inibidores competitivos. O fato destas enzimas serem inibidas apenas por Swainsonina em concentrações razoáveis, permite a sua classificação como tipo II. Isso sugere que elas são derivadas da forma lisossômica, embora apresente pH ótimo alterado. / Studies of intestinal function were prompted after noticing that the gut is a huge and relatively unprotected interface between the insect and the environment and can thus be used as a target for pest control. In this context, our work involves the purification and characterization of an soluble alpha-mannosidase and detection of a membrane α-mannosidase. α-Mannosidases are a family of exoglycosidases which hydrolyse α-D-mannosyl residues from terminal non-reducing end of oligossacharides. These enzymes are implicated in the catabolism of carbohydrates and N-linked protein glycosylations in insects, but little is known on this biochemistry. T.molitor is a Coleoptera studied in our laboratory because of its relevance as agricultural pest and its position at a strategic point in the phylogenetic tree of insects. α-Mannosidase is more active in the anterior and middle midgut content of T.molitor larvae, although there is a significant activity in the membrane fraction. To confirm the existence of this membrane enzyme, microvilli were purified by differential precipitation with calcium. Aminopeptidase was used as a marker, since it is known that it is a typical microvilar membrane enzyme. Most α-mannosidase activity is soluble. This led us to purify this enzyme for further characterization. The purification of T. molitor α-mannosidase was attained by using a combination of four chromatographic steps: an anion-exchange chromatography in Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), two gel filtration chromatographies, one in Superdex 200 and another in Superdex 75 (Amersham/Bioscience) using an AKTA system, and the last step is a Hydrophobic cromatography in Phenyl Superose. Two peaks of activity were resolved: Man 1 and Man 2, suggesting the existence of two soluble α-mannosidases, differing only in hydrophobicity. The optimum pH of the α- mannosidases is 5.6 and the molecular mass is 123 KDa determined by gel filtration and 70 KDa in the case of SDS PAGE. This suggests that the holoenzyme has two subunits. In a native gel revealed with the fluorescent substrate (methylumbelliferyl-α-D-mannopyranoside) only one band of activity is seen. Man 2 has pI 3.38. T. molitor α-mannosidases followed Michaelis-Menten kinetics with a Km value of 0.84 mM for Man 1 and 0.62 mM for Man 2 using p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside as substrate. Inhibition tests were made with typical inhibitors of α-mannosidases: one is the 1-deoxymannojirimycin and the other is the Swainsonine. The Ki for the first was of 0.12 mM for Man 1 and 0.15 mM for Man 2 and for the second was 67.8 nM for Man 1 and 63 nM for Man 2. Both were competitive inhibitors. The fact that the enzymes are inhibited only by swainsonine in reasonable concentrations, allows us to classify them as type II. This suggests that they are derived from the lysosomal form, although they have an altered optimum pH.

Devido aos problemas, ambientais e à população humana, causados pelos inseticidas químicos, novas investigações para o controle de insetos tornaram-se necessárias. Para isto, um maior conhecimento sobre a fisiologia digestiva dos insetos torna-se essencial, visto que o intestino é uma interface, grande e relativamente desprotegida, entre o inseto e o seu ambiente. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma dipeptidase e de uma carboxipeptidase digestivas de T. molitor. Estas enzimas, compreendem as classes de enzimas digestivas de insetos menos estudadas. O estudo de distribuição das atividades de dipeptidase e carboxipeptidase nas diferentes regiões do intestino médio de larvas de T. molitor mostrou que essas enzimas encontram-se majoritariamente no conteúdo luminal. Para a purificação da dipeptidase e carboxipeptidase foram utilizadas cromatografias de troca iônica e filtração em gel. A carboxipeptidase purificada era muito instável para estudos mais detalhados. O estudo dos parâmetros cinéticos mostrou que a dipeptidase digestiva de T. molitor possui massa molecular de 38,6 kDa, pH ótimo 7,4, baixa solubilidade a fenantrolina e parece preferir dipeptídeos com cadeia lateral volumosa na posição P1. Devido a essas propriedades, mesmo sendo solúvel, assemelha-se a dipeptidase de membrana (EC 3.4.13.19). / Because of adverse effects caused by insecticides in environment and in animals and humans, new methods for insect control are necessary. Knowledge on insect digestive physiology may be instrumental in this direction, as the gut is the major interface between insect and its environment. Our work involves the purification and characterization of a digestive carboxypeptidase and a digestive dipeptidase from Tenebrio molitor. Those enzymes comprise the class of insect digestive enzymes less studied. Distribution studies showed that T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase are more active in the midgut content. The purification of T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase was attained using a combination of anion-exchange chromatographies and gel filtration. The optimum pH of dipeptidase is 7.6 and the carboxypeptidase is 7.4. The kinetic parameters showed that the T. molitor digestive dipeptidase prefers as substrates dipeptides having a large lateral chain in P1 position.