Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:18:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2016 / O desenvolvimento de novas moléculas que auxiliam a manipulação de ácidos nucleicos é um tema que vem sendo alvo de grandes estudos nas áreas de bioquímica, biologia molecular, biotecnologia e química bioinorgânica, onde se buscam complexos que apresentam interação e/ou clivagem de ácidos nucleicos. Nestas áreas busca-se cada vez mais um modo de aprimoramento e incremento da seletividade destes complexos por regiões específicas do DNA. Dentro deste contexto, neste trabalho foram avaliados os potenciais de interação e clivagem de DNA através de 5 complexos binucleares biomiméticos derivados de fosfatases ácida púrpura, tomando como base o complexo FeZn-L0 e adicionando cadeias carbônicas de diferentes tamanhos com diaminas, como um modo de mimetizar a segunda esfera de coordenação da enzima. Todos os cinco complexos foram capazes de clivar o DNA plasmdial de um modo concentração-dependente. A variação do pH alterou significativamente a atividade destes complexos, o que indicou um mecanismo de clivagem semelhante àquele sugerido para a hidrólise do substrato modelo 2,4-BDNPP. Todos os complexos tiveram sua atividade inibida quando adicionado à reação concentrações crescentes dos sais NaCl e LiClO4, indicando que a neutralização das cargas do DNA pelos íons Na+ afeta diretamente o processo de catálise. Nenhum dos sequestradores de espécies reativas de oxigênio utilizados neste trabalho foram capazes de alterar a clivagem do DNA pelos complexos, sugerindo um mecanismo de atividade sem a participação de oxigênio, fato confirmado posteriormente pelo ensaio de clivagem na ausência de oxigênio em atmosfera de argônio. Foi possível perceber ainda que os complexos que apresentam as maiores cadeias carbônicas possuem uma preferência de interação com DNA através do sulco maior, sendo que o complexo que possui a menor cadeia carbônica não apresentou especificidade por ambos os sulcos, porém necessitou acessar o DNA por um destes. O complexo que não possui cadeia carbônica, por sua vez, apresentou uma preferência de interação ao DNA através do sulco menor. As constantes cinéticas encontradas neste trabalho mostraram que a inserção destas cadeias carbônicas ao complexo aumentou em até 5.5 vezes a eficiência catalítica dos mesmos. O ensaio de dicroísmo circular demonstrou que todos os complexos estudados foram capazes de alterar a estrutura secundária do DNA, diminuindo sua helicidade e o empilhamento de bases, fenômeno encontrado na literatura por moléculas que são capazes de acessar o DNA através dos sulcos maior ou menor. Por fim, ensaios de interação dos complexos com oligonucleotídeos demonstraram através da técnica de footprinting que os complexos são capazes de interagir com esta molécula e dificultar a clivagem do DNA pelo Fe-EDTA, principalmente em locais onde predominam bases pirimídicas, sugerindo uma especificidade destes complexos por estas regiões. De modo geral, a inserção de cadeias carbônicas como um modo de mimetizar uma segunda esfera de coordenação nestes complexos é uma estratégia viável para potencializar a atividade destas moléculas artificiais quanto a interação e clivagem de DNA.<br> / Abstract : The development of new molecules that aid in the handling of nucleic acids has been the subject of many studies in the fields of biochemistry, molecular biology, biotechnology and bioinorganic chemistry, searching for complexes that are capable of interacting and/or cleaving these molecules. These studiesfocus on the increase and enhancement selectivity of complexesto specific regions of DNA. In this context, this study evaluated the potential of interaction and cleavage of DNA by 5 biomimetic binuclear complexes derived from acid purple phosphatases, where,based on FeZn-L0 complex,carbon chains ofdifferent sizes containing diamines were added, in order to mimic the second coordination sphere of the model enzyme. All five compounds were able to cleave plasmid DNA in a concentration-dependent manner. Variations of pH changed significantly the activity of these complexes, which indicated a similar cleavage mechanism to the one suggested for the hydrolysis of the model substrate 2,4-BDNPP. All complexes had their activity inhibited by the additionof increasing concentrations of NaCl and LiClO4 saltsto the reaction, indicating that neutralization of DNA charges by Na + ions directly affects the catalysis process. None of the scavengers of reactive oxygen species used in this study were able to change the cleavage of DNA, suggesting activity reaction mechanism without the participation of oxygen, a fact later confirmed by the cleavage assay in the absence of oxygen.It was perceived that the complexes having longer carbon chains had a preferably interaction to DNA through the major groove.The complex with smaller carbon chain displayedno specificity for both grooves, but still required access to the grooves to bind with DNA. The kinetic constants found in this study indicated that the inclusion of these carbon chains tothe complex increased by up to 5.5 times the catalytic efficiency of the complexes.The circular dichroism assay demonstrated that all studied complexes were able to alter the secondary structure of DNA, by reducing its helicity and base stacking, a phenomenon found in the literature on molecules that are able to access the DNA through major or minor grooves. Lastly, interaction assays between complex and oligonucleotides,evaluated by ahydroxyl radical footprinting technique, showed that the complexes are capable of interacting and hinder cleavage of DNA by Fe-EDTA generated hydroxyl radicals, particularly in regions rich in pyrimidine bases, suggesting a specificity of these complexes tothese regions. In general, the inclusion of carbon chains as a way to mimic the second coordination sphere in these complexes is a viable strategy to potentiate the activity of these artificial molecules tointeract and cleave DNA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/175870 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Gabriel, Philipe |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Terenzi, Hernán Francisco |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 156 p.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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