Memoria para optar el título de Bioquímico / En Chile, la tasa de mortalidad por enfermedades oncológicas ha ido aumentando año a año, siendo las cifras cada vez más preocupantes. Es por eso, que cualquier aporte que pueda hacerse en este ámbito puede ser fundamental para combatir el cáncer. Uno de los frentes de lucha dentro de la ciencia es la Inmunología, que, mediante la comprensión de los procesos de defensa del cuerpo contra distintos patógenos o agentes causales de enfermedades, estudia como contrarrestar los mecanismos tumorales de evasión inmune. Dentro del Sistema Inmune (SI) una función fundamental la cumplen las células Natural Killers (NK), componentes principales de la respuesta inmune innata antitumoral. Distintos tumores han desarrollado estrategias para evadir esta respuesta.
En este contexto, NKG2D representa uno de los receptores más importantes en la inducción de la respuesta de citotoxicidad por parte de NK humanas. Los principales ligandos de NKG2D humano, NKG2DL, son moléculas no clásicas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I, MICA y MICB, que corresponden a la cadena relacionada al MHC clase I (MIC), y se expresan en la superficie de tumores, células infectadas por virus y estresadas.
Pese a la existencia de estos ligandos en la superficie del tumor, que alertan al SI de la existencia de éste, existen mecanismos oncológicos con los cuales se logra evadir la inmunovigilancia. Son varias las formas por las que ocurre este proceso. Se ha descrito la participación de citoquinas que estarían disminuyendo la expresión de los NKG2DL en la superficie, o metalopreoteasas que los cortarían liberándolos al medio, procesos que tendrían una relación directa con la disminución del ataque de las células NK al tumor. Al respecto, en nuestro laboratorio hemos detectado que IL-10 disminuye la expresión de MICA en la superficie de las células de melanoma. Además, creemos que otra forma por la cual el tumor podría estar evadiendo la inmunovigilancia por parte de las células NK, sería a través de la retención de los NKG2DL en el interior de la célula tumoral blanco. Al respecto creemos que una candidata a estar involucrada en el proceso es Calreticulina (Crt), que forma parte del complejo de proteínas chaperonas, Calnexina-Calreticulina-ERp57, involucradas en el procesamiento de las moléculas MHC-I.
Crt es una molécula chaperona del Retículo Endopasmático (RE) presente en todas las células del organismo, y cuya función fundamental es unir Calcio y participar en el procesamiento de glicoproteínas. Se ha visto que la sobreexpresión de esta regula negativamente la expresión y capacidad funcional en superficie de algunas proteínas de membrana.
Por ende, bajo la luz de los antecedentes, nuestro objetivo es determinar, en líneas celulares de melanoma, si Crt retiene o altera la expresión de MICA y MICB, y si esto es influenciado de alguna forma por IL-10, como mecanismo de evasión de la inmunovigilancia de las células NK.
Para estudiar esto, en primer lugar, realizamos ensayos de Microscopía Confocal (MC) con el fin de estudiar en células de melanoma la distribución de los ligandos MICA y MICB, y su relación con Crt, además de ver si su comportamiento era o no influenciado por IL-10. Posteriormente, se realizaron ensayos de inmunoprecipitación (IP) para verificar si existía una interacción directa de Crt con MICA y MICB. Finalmente, y con el fin de estudiar si Crt tenía alguna incidencia en la expresión de MICA y MICB en la superficie de las células, se realizó una mutagénesis sitiodirigida a Vasostatina, fragmento N-terminal de Crt que cumple la función de chaperona, de forma que no pudiese interactuar con ligandos, además de, en forma paralela, sobreexpresarla. Los productos resultantes fueron clonados y expresados en células HEK. Para detectar si existía alguna variación en el patrón de expresión superficial de MICA y MICB en las células, producto de la mutación o sobreexpresión de Vasostatina, se realizó un ensayo de Citometría de Flujo (CF), además de un ensayo de Western Blot (WB) para ver si era posible detectar Vasostatina sobreexpresada en las células a nivel proteico.
En nuestros resultados logramos observar que MICA y MICB se co-expresan frecuentemente en líneas celulares de melanoma, detectándose compartimentalizados en el interior del citoplasma, RE, además de observarse su presencia en el núcleo. Mediante IP observamos que MICA y MICB tienen un patrón de migración de doble banda, además de una tercera banda de mucho menor tamaño, cuando se revela con anticuerpo específico. Lo anterior indicaría que MIC soluble se podría estar generando en el interior de la célula, en forma complementaria a su liberación desde la superficie celular por efecto de metaloproteasas. Por su parte, por IF, observamos que Crt colocaliza con MICA y MICB, en el interior de las células de melanoma, lo cual también se produce en el núcleo. Además, por IP, vimos que Crt que inmunoprecipita con MICA, solamente en la banda que corresponde a la segunda de menor peso molecular.
Por otro lado, mediante IF no logramos detectar que IL-10 afectase la distribución citoplasmática de MICA y MICB.
Finalmente, al sobreexpresar y mutar Vasostatina no logramos apreciar algún efecto importante sobre el nivel de expresión de MICA y MICB en la superficie de las células HEK. Como conclusión podemos decir que MICA y MICB se encuentran agrupados en el interior de las células de melanoma y que interactúan con Crt, requiriéndose estudios posteriores a fin de determinar si esto constituye o no un mecanismo de evasión de la inmunovigilancia de las células NK
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105297 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Gatica Andrades, Marcela Daniela |
| Contributors | Puente Piccardo, Javier, Molina Sampayo, María Carmen, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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