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Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O Sistema Complemento (SC) desempenha papel importante no controle de infecções atuando na eliminação do patógeno e na regulação da resposta imune. Contudo, uma ativação desregulada do SC gera efeitos deletérios ao hospedeiro, contribuindo para a patogênese de diversas doenças, como na Dengue. Entretanto, o envolvimento do SC na infecção pelo vírus Dengue (DENV) ainda tem vários aspectos a serem investigados. Assim, avaliamos a contribuição do SC na infecção in vitro de monócitos pelo DENV; o perfil de expressão dos Receptores de Complemento (CR) CR1, CR2, CR3, CR4, CD46, CD55 e CD59, e de moléculas de ativação nos monócitos e linfócitos T circulantes de pacientes infectados pelos DENV-1,-2 ou -4 por citometria de fluxo. Dosamos os níveis de SC5b-9 e citocinas em pacientes por ELISA. Avaliamos ainda, a contribuição da ativação do SC na permeabilidade e viabilidade endotelial, utilizando modelo in vitro de células endoteliais (CEs) pela medida da resistência elétrica transendotelial (TEER) e liberação de LDH sobrenadante de culturas. Por fim investigamos a interação DENV-2 com componentes purificados do SC por eletroforese das proteínas. Como achados principais, observamos diminuição na frequência de monócitos CD14+ expressando CR3, CR4 e CD59 em pacientes comparado aos controles saudáveis. De forma interessante, o bloqueio do CR3 levou à diminuição em cerca de 30% da infecção in vitro pelo DENV-2 em monócitos, sem alterar o fenótipo de ativação ou a ativação da caspase-1 destas células. No entanto, com o bloqueio de CR3, detectamos diminuição na produção de TNF-alfa e IFN-alfa. Não observamos diferença significativa na frequência de linfócitos T expressando CR3, CD46, CD55 e CD59 de em pacientes-Dengue-4
Apesar disso, os linfócitos T CR+ apresentaram um perfil ativado coexpressando CD29, CCR5 e CD107a. Na infecção pelo DENV, independente do sorotipo viral, detectamos elevados níveis circulantes de SC5b-9. Na infecção pelo DENV-1/-2 os níveis mais elevados de SC5b-9 foram observados em pacientes que apresentaram sangramentos e extravasamento plasmático, enquanto nos pacientes-DENV-4, os níveis de SC5b-9 foram correlacionados diretamente com a manutenção da integridade vascular. Entretanto, o SC5b-9 parece estar associado com a liberação de LDH intracelular. Finalmente, vimos que DENV-2 promove a clivagem de C3 na ausência de fator D. Nossos dados sugerem que uma frequência diminuída de monócitos expressando CR3 em pacientes poderia ser uma tentativa de controle da infecção, uma vez que detectamos diminuição da infecção, com o bloqueio de CR3 in vitro e ainda, vimos que o DENV-2 modula a clivagem de C3. O aumento da frequência de linfócitos T CR+ coexpressando moléculas de ativação sugere que células de perfil ativado, capazes de controlar a infecção, estariam protegidas da lise via SC. Confirmamos que o SC está ativado na Dengue, pelos altos níveis de SC5b-9. Entretanto, os níveis de SC5b-9 foram associados com a gravidade nos pacientes-DENV-1/-2 enquanto, nos pacientes-DENV-4 foram correlacionados com a manutenção da integridade vascular. Esses dados sugerem que a ativação do SC estaria relacionada diferencialmente com a patogênese de acordo com o sorotipo da infecção / The complement system (CS) develops an important role in the infection control, by
direct elimination of pathogens and regulation o
f the immune response. However, a
deregulated CS activation is responsible to induce deleterious effects to the host,
contributing to the pathogenesis of several diseases, including Dengue. Besides this,
the involvement of the CS on Dengue virus (DENV) inf
ection still has many aspects to
be investigated. So, we evaluated the CS contribution during
in vitro
infection of
monocytes by DENV; the profile of complement receptors (CR) CR1, CR2, CR3, CR4,
CD46,CD55 and CD59 expression on circulating monocytes and T
cells from DENV
-
1,
-
2 or
-
4 infected patients by flow cytometry. We assessed the levels of SC5b
-
9 and
cytokines in patients by ELISA. We evaluated the contribution of the CS activation on
endothelial permeability and viability by using an
in vitro
model wi
th endothelial cells by
accessing the transendothelial electric resistence (TEER) and LDH release on culture
supernatants. Finally, the interaction of DENV
-
2 and purified components was
evaluated by electrophoresis of proteins. As principal findings, we ob
served decreased
frequencies of CD14 monocytes expressing CR3, CR4 and CD59 in patients compared
to healthy controls. Interestingly, the blockage of CR3 resulted in around 30% reduction
of the DENV
-
2 infection in monocytes
in vitro
, without alteration on
activation
phenotype neither on caspase
-
1 activation, of these cells. However, with CR3
-
blocking
we detected decreased production of TNF
-
alpha and IFN
-
alpha. Unaltered frequencies
of T cells expressing CR3, CD46, CD55 and CD59 were found in DENV
-
4. Beside
s, T
cells CR+ presented an activated profile, by the coexpression of CD29, CCR5 e
CD107a. In DENV infection, regardless the viral serotype, we detected increased levels
of circulating SC5b
-
9. However among the two groups of patients we saw controversial
r
esults. In the DENV
-
1/
-
2 infection higher levels of SC5b
-
9 were detected in patients
with bleeding and vascular leakage, while in DENV
-
4 patients, the levels of SC5b
-
9
were directly correlated with the maintenance of the vascular integrity. Although, the
SC5b
-
9 levels is associated to release of intracellular LDH. Finally, we saw that DENV
-
2
promotes C3 cleavage in the absence of factor D. Our data suggest that a decreased
frequency of CR3
-
expressing monocytes in DENV
-
patients would aim to control the
infe
ction, since
in vitro
, we detected decreased infection when CR3 was blocked e also,
DENV
-
2 seems to modulate the cleavage of C3. The increased frequency of T cells
CR+ coexpressing activation molecules suggest that cells with activated profile, able to
con
trol the infection, would be protected of CS mediated lysis. We confirmed that CS is
activated during Dengue, by the high levels of SC5b
-
9. However, the levels of SC5b
-
9
were associated with to severity in DENV
-
1/
-
2 patients, while in DENV
-
4 it was directl
y
correlated with the maintenance of the vascular integrity. These data suggest that CS
activation would be differentially related to the disease pathogenesis in accordance to
the serotype of the infection
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13706 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Marinho, Cintia Ferreira |
| Contributors | Bozza, Patrícia Torres, Arruda, Luciana Barros de, Bou Habib, Dumith Chequer, Pinto, Marcelo Alves, Paes, Marciano Viana, Pinto, Luzia Maria de Oliveira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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