Afin de se répliquer, les rétrovirus doivent disposer à la fois d’ARN épissés et non épissés. Chez le virus du Sarcome de Rous (RSV), l’accumulation de l’ARN non épissé dépend de l’élément NRS (Negative Regulator of Splicing). L’élément NRS est un élément bipartite. Sa région 5’ est assimilée à une séquence ESE (Exon Splicing Enhancer) à laquelle se fixent de nombreuses protéines SR tandis que sa région 3’ contient un pseudo-site 5’ non fonctionnel qui constitue un leurre qui est responsable de l’inhibition de l’épissage à l’unique site 5’ fonctionnel du virus. Seule la structure 3D de la partie 3’ du NRS qui contient le pseudo-site a été expérimentalement établie. Dans ce travail, nous avons déterminé la structure 2D de la totalité de l’élément NRS à l’aide de sondes chimiques et enzymatiques. La comparaison de cette structure expérimentale à celles que nous avons établies pour d’autres éléments NRS mutants fonctionnels et non fonctionnel ainsi qu’à celles théoriques de la totalité des virus aviaires séquencés argumente en faveur de la forte signification biologique de notre modèle. Des expériences d’épissage in vitro réalisées sur l’élément NRS sauvage ainsi que ses formes tronquées ont permis de mettre en évidence le rôle crucial de deux structures tige-boucles dans la fonction du NRS. Les expériences de purification de complexes formés avec un extrait nucléaire de cellules HeLa sur ces différents éléments NRS par des techniques chromatographie d’affinité ont permis de démontrer l’importance de l’association de ces deux structures tige-boucles avec les protéines SR et la snRNP U1. Nous avons défini un nouvel élément NRS minimal fonctionnel capable d’inhiber l’épissage et nous avons démontré l’activation de l’inhibition de l’épissage de l’élément NRS par la protéine 9G8 in vitro et in cellulo / Retroviruses require both spliced and unspliced RNAs for productive replication. Accumulation of unspliced RNA in Rous Sarcoma Virus (RSV) depends on the NRS element, (Negative Regulator of Splicing). The NRS element is bipartite. Its 5’ terminal part is considered as an ESE that binds SR proteins and its 3’ part contains a decoy 5’-splice site (ss), which inhibits splicing at the bona fide 5’ ss. Only the 3D structure of a small NRS fragment including the decoy 5’ ss had been experimentally studied. Here, by chemical and enzymatic probing of entire RSV NRS, we determine its 2D structure. By comparative analysis of 2D structures of functional and non-functional avian NRS variants and of all sequenced avian NRSs, we bring strong arguments for a biological significance of the established structure. By in vitro splicing assays, we show a crucial role of two of the established stem-loop structures and by affinity purification of complexes formed by WT and truncated NRSs in HeLa cell nuclear extract, we demonstrate their importance for SR protein and U1 snRNP association. We define a new small NRS element retaining splicing inhibitory properties and finally demonstrate the capability of the SR protein 9G8 to increase NRS activity in vitro and in cellulo
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2011NAN10153 |
| Date | 17 November 2011 |
| Creators | Bar, Aileen |
| Contributors | Nancy 1, Branlant, Christiane |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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