Afin de se répliquer, les rétrovirus doivent disposer à la fois d’ARN épissés et non épissés. Chez le virus du Sarcome de Rous (RSV), l’accumulation de l’ARN non épissé dépend de l’élément NRS (Negative Regulator of Splicing). L’élément NRS est un élément bipartite. Sa région 5’ est assimilée à une séquence ESE (Exon Splicing Enhancer) à laquelle se fixent de nombreuses protéines SR tandis que sa région 3’ contient un pseudo-site 5’ non fonctionnel qui constitue un leurre qui est responsable de l’inhibition de l’épissage à l’unique site 5’ fonctionnel du virus. Seule la structure 3D de la partie 3’ du NRS qui contient le pseudo-site a été expérimentalement établie. Dans ce travail, nous avons déterminé la structure 2D de la totalité de l’élément NRS à l’aide de sondes chimiques et enzymatiques. La comparaison de cette structure expérimentale à celles que nous avons établies pour d’autres éléments NRS mutants fonctionnels et non fonctionnel ainsi qu’à celles théoriques de la totalité des virus aviaires séquencés argumente en faveur de la forte signification biologique de notre modèle. Des expériences d’épissage in vitro réalisées sur l’élément NRS sauvage ainsi que ses formes tronquées ont permis de mettre en évidence le rôle crucial de deux structures tige-boucles dans la fonction du NRS. Les expériences de purification de complexes formés avec un extrait nucléaire de cellules HeLa sur ces différents éléments NRS par des techniques chromatographie d’affinité ont permis de démontrer l’importance de l’association de ces deux structures tige-boucles avec les protéines SR et la snRNP U1. Nous avons défini un nouvel élément NRS minimal fonctionnel capable d’inhiber l’épissage et nous avons démontré l’activation de l’inhibition de l’épissage de l’élément NRS par la protéine 9G8 in vitro et in cellulo / Retroviruses require both spliced and unspliced RNAs for productive replication. Accumulation of unspliced RNA in Rous Sarcoma Virus (RSV) depends on the NRS element, (Negative Regulator of Splicing). The NRS element is bipartite. Its 5’ terminal part is considered as an ESE that binds SR proteins and its 3’ part contains a decoy 5’-splice site (ss), which inhibits splicing at the bona fide 5’ ss. Only the 3D structure of a small NRS fragment including the decoy 5’ ss had been experimentally studied. Here, by chemical and enzymatic probing of entire RSV NRS, we determine its 2D structure. By comparative analysis of 2D structures of functional and non-functional avian NRS variants and of all sequenced avian NRSs, we bring strong arguments for a biological significance of the established structure. By in vitro splicing assays, we show a crucial role of two of the established stem-loop structures and by affinity purification of complexes formed by WT and truncated NRSs in HeLa cell nuclear extract, we demonstrate their importance for SR protein and U1 snRNP association. We define a new small NRS element retaining splicing inhibitory properties and finally demonstrate the capability of the SR protein 9G8 to increase NRS activity in vitro and in cellulo

Ce travail de thèse a comporté deux parties distinctes : l'une porte sur l'étude du complexe TAR/Tat/cycline T1 impliqué dans la transactivation de la transcription de l'ARN du virus HIV-1, l'autre concerne différentes facettes de la régulation de l'épissage de l'ARN du virus HIV-1. L'interaction de la protéine virale Tat avec l'élément TAR présent à l'extrémité 5' des ARN du virus HIV-1 d'une part, et la cycline T1, composant du complexe p-TEFb responsable de l'hyperphosphorylation de l'ARN polymérase II d'autre part, est primordial pour obtenir des ARN viraux de pleine longueur. Dans l'objectif de réaliser une étude structurale du complexe TAR/Tat/cycline T1, l'ARN TAR et un fragment de la cycline T1 ont été produits en grandes quantités. De nombreuses tentatives de complexation des trois partenaires (TAR, Tat et cycline T1) ont été effectuées, mais la qualité des cristaux n'était pas suffisante pour une étude radiocristallographique du complexe. L'épissage est une étape majeure du cycle de multiplication du virus HIV-1. Son ARN comporte 5 sites donneurs et 8 sites accepteurs dont l'utilisation combinée permet la production des 9 ORF virales. Les variations de l'épissage alternatif de l'ARN du virus HIV-1 en fonction de l'expression de protéines virales Tat et Nef ont été étudiées. Nous avons par ailleurs étudié l'effet des protéines SR sur l'utilisation des sites accepteurs A2 et A3. L'étude fine de l'élément régulateur ESEt du site A3 a révélé l'implication de la protéine SR 9G8 dans le schéma complexe de régulation de ce site. / This work of thesis contained two different parts : the one concerns the study of the TAR/Tat/cycline T1 complex involved in the transactivation of the transcription of the HIV-1 RNA, the other one concerns various facets of the regulation of the splicing of the HIV-1 RNA. The interaction of the viral protein Tat with the TAR element present in the 5 ' extremity of the HIV-1 RNA on one hand, and the cycline T1, composing of the complex p-TEFb responsible for the hyperphosphorylation of the RNA polymerase II on the other hand, is essential to obtain viral RNA of full length. In the objective to realize a structural study of the complex TAR/Tat/cycline T1, TAR RNA and a fragment of the cycline T1 were produced in appropriate quantities. Numerous attempts of complexation of three partners (TAR, Tat and cycline T1) were made, but the quality of crystals was not sufficient for a radiocristallographic study of the complex. Splicing is a major stage of the cycle of reproduction of the virus HIV-1. His RNA contains 5 donor splice sites and 8 acceptor splice sites whose combined use allows the production 9 viral ORF. The variations of the alternative épissage of HIV-1 RNA according to the expression of viral proteins Tat and Rev were studied. We besides studied the effect of proteins SR on the use of acceptor splice sites A2 and A3. The fine study of the regulating element ESEt of the site A3 revealed the involvement of the SR protein 9G8 in the complex regulation of this site.

La télomérase, composée de l‘ARN TR et de la protéine TERT, responsable du maintien de la longueur des télomères est surexprimée dans la majorité des cellules cancéreuses. La dynamique de la régulation post-transcriptionnelle de TERT sur l‘activation de la télomérase a été étudiée dans le modèle de lymphomagenèse induite par l‘herpesvirus oncogène aviaire de la maladie de Marek. L‘augmentation de l‘activité télomérase des TCD4+ lors de l‘apparition des lymphomes résulte d‘une hausse du transcrit constitutif et de celle des transcrits cibles de la voie de dégradation du « non-sense mediated decay » (NMD) alors que l‘activité télomérase basale des TCD4+ non infectés est contrôlée par les isoformes dominantes négatives. La caractérisation de la protéine virale ICP27 de MDV-1, régulateur potentiel de l‘épissage des gènes, qui s‘exprime pendant la phase de réplication lytique du virus a complété cette étude. ICP27 est capable de co-localiser et d‘interagir avec les protéines SR du splicéosome ainsi que de réguler négativement l‘épissage des gènes cellulaire TERT et viral vIL8 de manière similaire à ICP27 de l‘herpesvirus simplex 1. Le modèle naturel de lymphomagenèse induite par MDV-1 a permis d‘établir pour la première fois un lien entre l‘activation de la télomérase in vivo et la régulation de l‘épissage de TERT, à laquelle pourrait participer la protéine virale ICP27. / The telomerase, consisting of an RNA template (TR) and a reverse transcriptase (TERT) maintains telomere length and is highly expressed in the majority of cancer cells. The splicing regulation of TERT was studied in Marek‘s disease (MD), a natural lymphoma induced by MDV-1, the avian MD herpesvirus. Telomerase activation observed in TCD4+ cells at the onset of MD lymphoma was due to an increase of constitutively spliced and « non-sense mediated decay » (NMD) while basal telomerase activity of non infected TCD4+ cells was controlled by dominant negative isoforms. In addition, the viral protein ICP27, a putative regulator of splicing, expressed during MDV-1 lytic infection was characterised. ICP27 co-localized and interacted with spliceosome SR proteins and negatively controlled splicing of TERT and vIL8 viral gene in a way similar to that of ICP27 of herpesvirus simplex 1. The MD model provides the only data on the in vivo regulation of TERT splicing, possibly mediated by ICP27, and telomerase activation during lymphomagenesis induced by a herpesvirus in its natural host.

La protéine EB2 du virus d'Epstein-Barr (EBV) est une protéine du cycle réplicatif du virus indispensable à la production de particules virales. Elle permet l’accumulation dans le cytoplasme de certains ARNm viraux issus de gènes dépourvus d’intron. Pour mettre en évidence les mécanismes qui permettent à EB2 d’exporter ses ARNm cibles dans le cytoplasme, nous avons identifié différents partenaires cellulaires d’EB2 et nous avons étudié certaines de ces interactions d’un point de vue fonctionnel. Nous avons pu montrer qu’EB2 recrute directement le facteur général d'export des ARNm, TAP/NXF1, ce qui lui permet d’être exportée du noyau vers le cytoplasme. Puis nous avons montré qu’EB2 interagit avec SRp20, une protéine impliquée notamment dans la régulation de l'épissage et l'export des ARNm cellulaires. Cette interaction entre EB2 et SRp20 est indispensable pour l’accumulation dans le cytoplasme de certains ARNm cibles d’EB2, notamment parce que SRp20 semble permettre le recrutement d'EB2 sur ces ARNm. Enfin, nous avons montré qu’EB2 forme un dimère et nous avons caractérisé le domaine de la protéine responsable de cette interaction. La dimérisation d'EB2 semble essentielle pour que la protéine interagisse avec certains de ses partenaires comme SRp20 ou encore REF. / The Epstein-Barr virus (EBV) protein EB2 is an early protein essential for the production of infectous virions. EB2 allows the cytoplasmic accumulation of a subset of viral mRNAs derived from intronless genes. To highlight the mecanisms by which EB2 exports his targets mRNA, we identified cellular partners and studied the functional role of some of these interactions. We showed that EB2 recruits directly the cellular mRNA export factor TAP/NXF1 and this interaction allows EB2’s shuttling between the nucleus and the cytoplasm. The we showed that EB2 interacts with SRp20, a cellular protein implicated in splicing regulation and mRNA export. This interaction is essential for the efficient cytoplasmic accumulation of some EB2 target mRNAs, partly because SRp20 appears to be able to recruit EB2 on these mRNAs. Then we showed that EB2 dimerises and we characterized the domain necessary for this interaction. This dimerisation appears to be essential for EB2’s interaction with several partners, including SRp20 and REF.

Les protéines SR, qui constituent une famille conservée de facteurs liant l'ARN, jouent un rôle majeur dans l'épissage des ARN et en particulier dans la régulation de l'épissage alternatif. Certaines protéines SR peuvent également participer à l'élongation de la transcription, l'export, la stabilité ou la traduction des ARNm. Ces différents rôles soulignent l'importance des protéines SR en tant que régulateurs clés du métabolisme des ARNm et de l'expression des gènes. Des altérations de leur quantité ou de leur activité peuvent induire des défauts développementaux ou des pathologies telles que des tumeurs. Afin de mieux comprendre les fonctions et les mécanismes de régulation des protéines SR in vivo, je me suis intéressée à la protéine SR B52 chez D. melanogaster. En réalisant un crible génétique, nous avons identifié des protéines capables de sauver les phénotypes induits par la surexpression de B52 in vivo. L'une de ces protéines est l'ADN Topoisomérase I (Topo I). La Topo I possède à la fois une activité topoisomérase impliquée dans la relaxation de l'ADN, et une activité kinase capable de phosphoryler les protéines SR. Nous avons montré que B52 est impliquée dans le recrutement de la Topo I aux sites actifs de transcription, en particulier lors de l'induction des gènes heat shock, et que ces protéines jouent un rôle dans la libération de l'ARN hsp70 de son site de transcription et dans l'extinction de sa transcription. Une autre protéine capable de sauver les phénotypes induits par la surexpression de B52 est Brain tumor, un répresseur post-transcriptionnel de l'expression de myc. Myc est un régulateur clé de la croissance chez la drosophile. Nos résultats révèlent un effet positif de B52 sur la croissance cellulaire dans certains tissus, et sur l'expression de dmyc. Nous montrons également que le niveau de B52 affecte l'épissage alternatif de plusieurs gènes impliqués dans la croissance, dont le coactivateur transcriptionnel Yorkie et le facteur d'initiation de la traduction eIF4E. Ainsi, nos travaux suggèrent que la protéine SR B52 pourrait coordonner un ensemble d'évènements d'épissage dans des voies de signalisation impliquées dans la croissance cellulaire. / SR proteins, which constitute a conserved family of RNA-binding factors, play a key role in RNA splicing and particularly in alternative splicing regulation. In addition, some SR proteins have been shown to participate in transcription elongation, mRNA export, mRNA stability and mRNA translation. These wide-ranging roles of SR proteins highlight their importance as pivotal regulators of mRNA metabolism and gene expression. Alteration of their expression level or activity can induce developmental defects or pathologies such as tumors. To better understand SR proteins functions and how they are regulated in vivo, I studied a major SR protein in Drosophila melanogaster called B52. Using a genetic screen, we identified proteins that can rescue the phenotypes induced by B52 overexpression. Among them is the DNA Topoisomerase I (Topo I). Topo I carries two enzymatic activities: a topoisomerase activity that can relax DNA supercoiling generated by transcription or replication, and a kinase activity which phosphorylates SR proteins. We showed that B52 is required for Topo I recruitment to active transcription sites, especially at the heat shock genes upon their induction, and that these proteins play a role in hsp70 mRNA release from its transcription site and in its transcription shutdown. Another protein that can rescue the phenotypes induced by B52 overexpression is Brain tumor, a post-transcriptional repressor of myc expression. Myc is a major regulator of cell growth in Drosophila. Our results reveal a positive effect of B52 on cell growth in some tissues, and on myc expression. We also show that B52 level can affect the alternative splicing of several genes involved in cell growth, especially that of the transcriptional coactivator Yorkie and the translation initiation factor eIF4E. Thus, our work suggests that the SR protein B52 could coordinate a range of splicing events in signalling pathways involved in cell growth.

La protéine Tat du VIH-1 est essentielle à la multiplication virale. Elle permet la transactivation de la transcription et, par ses propriétés apoptotiques, elle participe à la pathologie SIDA. D'où l'importance d'étudier les mécanismes régulant sa production. L'épissage alternatif de l'ARN du VIH-1, en particulier, l'utilisation des sites accepteurs d'épissage A3 et A7 est nécessaire pour la production des ARNm tat. L'utilisation du site A3 est fortement régulée par des éléments agissant en cis contenus dans une structure tige-boucle SLS3A3 située en aval du site A3. En purifiant les complexes RNP formés en extrait nucléaire sur un segment de l'ARN viral renfermant le site A3, et en analysant par spectrométrie de masse les protéines contenues dans ces complexes, nous avons pu mettre en évidence la fixation d'une protéine inhibitrice de l'utilisation du site A3, la protéine DAZAP1. Sur la base d'un ensemble de données antérieures du laboratoire et de nouvelles données que j'ai obtenues, nous avons montré que la protéine SRSF7, sans doute en synergie avec SRSF1, limite la fixation de DAZAP1 et active l'épissage au site A3. Nous avons aussi montré que la protéine virale Tat exerce un rétro-contrôle négatif au niveau de la production de l?ARNm tat, ceci en limitant l'activation du site A3 par SRSF7. La partie apicale de la structure tige-boucle SLS3A3 (motif B) est très conservée dans les souches de VIH-1. L'équipe d'E Guittet a déterminé sa structure 3D par RMN. La conformation de sa boucle terminale est caractéristique des structures tige-boucle reconnues par les protéines à domaines dsRBD (double stranded RNA Binding Domain). J'ai pu confirmer cette hypothèse en purifiant les complexes formés par le motif B en extrait nucléaire. Nous avons ainsi pu montrer que la protéine kinase PKR, qui joue chez l'Homme un rôle majeur dans la réponse à une infection virale, est un partenaire du motif B. Par utilisation de sondes chimiques de la structure 2D de l'ARN, j'ai pu montrer que la structure tige-boucle SLS3A3, contenant le codon d'initiation de l'ORF Tat, est présente dans l'ARNm tat1. Nous avons alors développé un système visant à étudier les mécanismes de régulation de l'initiation de la traduction de la protéine Tat. Par l'emploi d'une construction bicistronique, j'ai pu confirmer l'existence d'une activité IRES dans la région 5'UTRtat1 de l'ARNm tat1 et définir deux segments ayant cette activité. Des résultats préliminaires obtenus avec une construction bicistronique, nous ont permis de commencer à tester l'effet de différentes protéines SR et hnRNP sur l'activité de ces IRES / HIV-1 Tat protein is essential for viral replication. It allows the transcription of full-length viral RNAs, and due to its apoptotic properties it contributes to the AIDS disease. Hence, it is important to study the mechanisms regulating its production. Alternative splicing of the HIV-1 RNA, in particular, the use of acceptor sites A3 and A7 is required for tat mRNA production. Splicing at site A3 is highly regulated by cis-acting elements contained in a stem-loop structure SLS3A3, located downstream from site A3. By purifying RNP complexes formed in nuclear extract on a segment of the viral RNA containing site A3 followed by mass spectrometry analysis, we were able to highlight the binding of a new inhibitory protein, DAZAP1. Based on a set of ancient laboratory data and new results that I obtained, we have shown that SRSF7 protein, probably in synergy with SRSF1, limits the binding of DAZAP1 and splicing activation at site A3. We also showed that the viral protein Tat exerts a negative feedback control on tat mRNA production by restricting splicing activation of site A3 by SRSF7. The apical part of the stem-loop structure SLS3A3 (B motif) is highly conserved among HIV-1 strains. E Guittet team determined its 3D structure by NMR. The conformation of this apical loop is characteristic of stem-loop structures recognized by dsRBD proteins (double-stranded RNA binding domain). I was able to confirm this hypothesis by purifying RNP complexes formed by the B motif in nuclear extract. Thus, we have shown that the RNA dependent protein kinase (PKR), which plays in humans a major role in response to viral infection, is a partner of the B motif. By using chemical probes specific of the 2D structure of RNAs, I showed that the stem-loop structure SLS3A3 that contains the initiation codon of Tat is present in tat1 mRNA. We then developed a system to study the mechanisms regulating the initiation of translation of Tat protein. By using a bicistronic construct, I was able to confirm the existence of IRES activity in the 5?UTRtat1 region of tat1 mRNA, and define two segments that contain this activity. Preliminary results obtained with a bicistronic construct allowed us to begin testing the effect of different SR and hnRNP proteins on the activity of the IRES