Les protéines solubles sont généralement faiblement immunogènes, ce qui constitue une limite pour le développement de vaccins sous unitaires à base de protéines. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif de décrypter certains mécanismes moléculaires et cellulaires qui contribuent à l'immunogénicité et d'en tirer partie pour développer des approches originales permettant d'améliorer la capacité des protéines à déclencher la réponse immunitaire. Pour cela, j'ai principalement utilisé le transactivateur transcriptionnel (Tat) du VIH-1. J'ai montré que l'oligomérisation de Tat permet à un mécanisme de collaboration B-TH-2 d'induire la réponse immunitaire en absence d'adjuvant. J'ai identifié le déterminant minimal responsable de l'effet et montré qu'il confère la propriété adjuvante à d'autres antigènes. J'ai ensuite montré que la présentation aux cellules T restreinte aux CMH I et CMH II est accrue lorsque les protéines sont dotées de la capacité à lier des sucres sulfatés d'expression ubiquitaire: les héparanes sulfate. Ces travaux ont permis de définir de nouvelles approches pour améliorer l'immunogénicité de protéines susceptibles d'être intégrées dans des préparations vaccinales.

La protéine Tat du VIH-1 est essentielle à la multiplication virale. Elle permet la transactivation de la transcription et, par ses propriétés apoptotiques, elle participe à la pathologie SIDA. D'où l'importance d'étudier les mécanismes régulant sa production. L'épissage alternatif de l'ARN du VIH-1, en particulier, l'utilisation des sites accepteurs d'épissage A3 et A7 est nécessaire pour la production des ARNm tat. L'utilisation du site A3 est fortement régulée par des éléments agissant en cis contenus dans une structure tige-boucle SLS3A3 située en aval du site A3. En purifiant les complexes RNP formés en extrait nucléaire sur un segment de l'ARN viral renfermant le site A3, et en analysant par spectrométrie de masse les protéines contenues dans ces complexes, nous avons pu mettre en évidence la fixation d'une protéine inhibitrice de l'utilisation du site A3, la protéine DAZAP1. Sur la base d'un ensemble de données antérieures du laboratoire et de nouvelles données que j'ai obtenues, nous avons montré que la protéine SRSF7, sans doute en synergie avec SRSF1, limite la fixation de DAZAP1 et active l'épissage au site A3. Nous avons aussi montré que la protéine virale Tat exerce un rétro-contrôle négatif au niveau de la production de l?ARNm tat, ceci en limitant l'activation du site A3 par SRSF7. La partie apicale de la structure tige-boucle SLS3A3 (motif B) est très conservée dans les souches de VIH-1. L'équipe d'E Guittet a déterminé sa structure 3D par RMN. La conformation de sa boucle terminale est caractéristique des structures tige-boucle reconnues par les protéines à domaines dsRBD (double stranded RNA Binding Domain). J'ai pu confirmer cette hypothèse en purifiant les complexes formés par le motif B en extrait nucléaire. Nous avons ainsi pu montrer que la protéine kinase PKR, qui joue chez l'Homme un rôle majeur dans la réponse à une infection virale, est un partenaire du motif B. Par utilisation de sondes chimiques de la structure 2D de l'ARN, j'ai pu montrer que la structure tige-boucle SLS3A3, contenant le codon d'initiation de l'ORF Tat, est présente dans l'ARNm tat1. Nous avons alors développé un système visant à étudier les mécanismes de régulation de l'initiation de la traduction de la protéine Tat. Par l'emploi d'une construction bicistronique, j'ai pu confirmer l'existence d'une activité IRES dans la région 5'UTRtat1 de l'ARNm tat1 et définir deux segments ayant cette activité. Des résultats préliminaires obtenus avec une construction bicistronique, nous ont permis de commencer à tester l'effet de différentes protéines SR et hnRNP sur l'activité de ces IRES / HIV-1 Tat protein is essential for viral replication. It allows the transcription of full-length viral RNAs, and due to its apoptotic properties it contributes to the AIDS disease. Hence, it is important to study the mechanisms regulating its production. Alternative splicing of the HIV-1 RNA, in particular, the use of acceptor sites A3 and A7 is required for tat mRNA production. Splicing at site A3 is highly regulated by cis-acting elements contained in a stem-loop structure SLS3A3, located downstream from site A3. By purifying RNP complexes formed in nuclear extract on a segment of the viral RNA containing site A3 followed by mass spectrometry analysis, we were able to highlight the binding of a new inhibitory protein, DAZAP1. Based on a set of ancient laboratory data and new results that I obtained, we have shown that SRSF7 protein, probably in synergy with SRSF1, limits the binding of DAZAP1 and splicing activation at site A3. We also showed that the viral protein Tat exerts a negative feedback control on tat mRNA production by restricting splicing activation of site A3 by SRSF7. The apical part of the stem-loop structure SLS3A3 (B motif) is highly conserved among HIV-1 strains. E Guittet team determined its 3D structure by NMR. The conformation of this apical loop is characteristic of stem-loop structures recognized by dsRBD proteins (double-stranded RNA binding domain). I was able to confirm this hypothesis by purifying RNP complexes formed by the B motif in nuclear extract. Thus, we have shown that the RNA dependent protein kinase (PKR), which plays in humans a major role in response to viral infection, is a partner of the B motif. By using chemical probes specific of the 2D structure of RNAs, I showed that the stem-loop structure SLS3A3 that contains the initiation codon of Tat is present in tat1 mRNA. We then developed a system to study the mechanisms regulating the initiation of translation of Tat protein. By using a bicistronic construct, I was able to confirm the existence of IRES activity in the 5?UTRtat1 region of tat1 mRNA, and define two segments that contain this activity. Preliminary results obtained with a bicistronic construct allowed us to begin testing the effect of different SR and hnRNP proteins on the activity of the IRES

Depuis sa découverte il y a plus de 30 ans, le Virus de l’Immunodéficience Humaine est à l’origine d’une importante mortalité dans le monde. De par la difficulté de tester l’efficacité de formulations thérapeutiques et/ou vaccinales directement chez l’homme, des études d’infections modèles du VIH, comme celle du Virus de l’Immunodéficience Féline (FIV), ont été entreprises ces dernières années. Au-delà de son intérêt vétérinaire, l’étude du FIV représente un avantage important pour trouver un moyen de contrôler les infections par les lentivirus tel que le VIH. Elle peut permettre de développer et surtout de tester l’efficacité des vaccins et/ou thérapies spécifiques chez le chat, dont le SIDA mime les symptômes et les modifications hématologiques rencontrés chez l’homme. Ce manuscrit s’est intéressé à l’étude structurale de deux familles de protéines virales de ces virus, les protéines lentivirales précoces (protéine Tat du VIH) et tardives (domaines Capside CA et Matrice MA de Gag du FIV). L’étude structurale de ces protéines et leur compréhension fonctionnelle au sein de l’hôte pourront à l’avenir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques et/ou vaccinales contre les lentivirus, palliant ainsi les problèmes existants de résistances virales / Since its discovery 30 years ago, the Human Immunodeficiency Virus is the cause of an important mortality worldwide. Because of the difficulty to test the efficiency of therapeutical and/or vaccinal formulations directly in humans, studies of models of HIV infections, such as the Feline Immunodeficiency Virus (FIV), have been performed in recent years. In addition to its veterinary interest, the study of FIV is an important issue to find a way to control infections by lentiviruses such as HIV. It can help to develop and test the efficiency of specific therapies and/or vaccines for cats, where AIDS mimics the symptoms and hematologic changes observed in humans. This manuscript describes the structural study of two types of viral proteins of these viruses, early lentiviral proteins (HIV Tat protein) and late lentiviral proteins (CA capsid and MA Matrix domains of FIV Gag). The structural study of these proteins and their functional understanding into the host will open new therapeutic and/or vaccine strategies against these lentiviruses in the future, in order to overcome the existing problems of viral resistance