Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Lors de la réplication du virus de la grippe, la protéine de matrice M1 prend part au transport des complexes vRNP. Elle interagit également avec les queues cytoplasmiques des protéines virales membranaires et la membrane plasmique de la cellule hôte au site d'assemblage, et est responsable de la structure de la particule virale. Le domaine N-terminal de M1, composé des 164 premiers acides aminés, possède deux motifs basiques exposés : un signal de localisation nucléaire (NLS, 101-105) sur l'hélice 6 et un triplet d'arginines (76-78) sur l'hélice 5. L'objectif de cette thèse était d'étudier (1) le rôle de ce domaine basique, en comparaison avec le NLS, dans l'accrochage membranaire de M1 et dans l'assemblage du virus de la grippe A/H1N1pdm2009 et (2) de définir dans notre système expérimental cellulaire les protéines virales requises pour la production de VLP (Virus Like Particles) de la grippe contenant M1. In vitro, par des tests de cosédimentation de protéines recombinantes M1 (domaine N-terminal) sauvages ou mutées avec des LUVs (Large Unilamellar Vesicles) contenant des lipides chargés négativement, il fut possible d'observer que les domaines basiques (NLS et triplet d'arginines) sont impliqués dans l'interaction M1-membranes biomimétiques, via une interaction électrostatique entre M1 et les lipides chargés négativement (comme la PS). In cellulo, nous avons pu observer que M1, lorsqu'elle est exprimée seule, ne s'accroche pas de manière efficace à la membrane. Par contre, lorsque M2 et NS1/NEP sont coexprimées, la fraction de M1 liée aux membranes est dix fois plus importante. De plus, la coexpression de M1, M2 et NS1/NEP nous permet d'observer la production de VLP par Western blot et AFM (Atomic Force Microscopy), même en absence des glycoprotéines d'enveloppe HA et NA. Par mutagenèse dirigée, nous avons pu observer que les résidus chargés négativement de la queue cytoplasmique de M2 sont nécessaires à la localisation membranaire de M1 et à la production de VLP, comme décrits dans la littérature. De manière intéressante, quand un mutant du triplet d'arginines est exprimé, il y a trois fois moins de M1 accrochée aux membranes (M1 reste cytosolique), et la production de VLP est fortement diminuée. Un mutant du NLS diminue également l'accrochage membranaire de M1 mais seulement de 10%. Ces domaines basiques, et plus particulièrement le triplet d'arginines, semblent donc être impliqués dans des interactions électrostatiques entre M1 et les lipides chargés de la membrane, ou M1 et les résidus chargés de la queue cytoplasmique de M2, ou les deux. L'ensemble de ces travaux apporte une nouvelle vision moléculaire de l'assemblage du virus de la grippe A/H1N1. / The M1 matrix protein, lying beneath the viral lipid envelop, plays many roles in influenza virus assembly. Not only it structures the viral particle but it also associates to the vRNP complexes in the nucleus and it supposedly binds to the cell plasma membrane and to the cytoplasmic tails of the viral membrane proteins at the assembly site. M1 N-terminal domain, composed of 164 amino acids, exhibits two basic domains: the NLS (Nuclear Localization Signal) on helix 6 and a triplet of arginines on helix 5. We decided to investigate the role of those basic domains regarding the molecular assembly mechanism of the influenza A/H1N1pdm2009 virus and the attachment of M1 at the cell membrane. In vitro, we observed that when the triplet of arginines is mutated, the percentage of M1 bound to LUVs (Large Unilamellar Vesicles) containing negatively charged lipids decreases, as it is the case for a full mutant of the NLS motif. In cellulo, by using cellular fractionation, membrane flotation assays, and immunofluorescence microscopy, we observed that when expressed alone, M1 is poorly bound to the cellular membranes whereas in the presence of NS1/NEP (Non Structural protein 1 and Nuclear Export Protein) and M2 viral proteins, the M1 membrane bound fraction is increased by 10 times. M2 appears to be essential for M1 membrane localization. In order to decipher the mechanism, we used directed site mutagenesis of M1 and M2. When we mutated some negatively charged residues of the M2 cytoplasmic tail, we no longer observed either the localization of M1 at the cell membrane or VLP (Virus Like Particles) production, in agreement with the literature. In addition, when we mutated the M1 arginine triplet, M1 remained cytosolic and VLP production was almost completely abolished, even when M2 and NS1/NEP were coexpressed. Whereas a mutant of the arginine triplet decreases by 20% the percentage of M1 attached to cellular membranes, a mutant of the NLS has a mild effect (10% of decrease is observed). Thus, M1 basic domains, particularly the arginine triplet, can trigger electrostatic interactions between M1 and the lipids, or M1 and the cytoplasmic tail of M2, or both, at the viral assembly site. These results highlight the molecular mechanism of A/H1N1 influenza virus assembly.

Depuis sa découverte il y a plus de 30 ans, le Virus de l’Immunodéficience Humaine est à l’origine d’une importante mortalité dans le monde. De par la difficulté de tester l’efficacité de formulations thérapeutiques et/ou vaccinales directement chez l’homme, des études d’infections modèles du VIH, comme celle du Virus de l’Immunodéficience Féline (FIV), ont été entreprises ces dernières années. Au-delà de son intérêt vétérinaire, l’étude du FIV représente un avantage important pour trouver un moyen de contrôler les infections par les lentivirus tel que le VIH. Elle peut permettre de développer et surtout de tester l’efficacité des vaccins et/ou thérapies spécifiques chez le chat, dont le SIDA mime les symptômes et les modifications hématologiques rencontrés chez l’homme. Ce manuscrit s’est intéressé à l’étude structurale de deux familles de protéines virales de ces virus, les protéines lentivirales précoces (protéine Tat du VIH) et tardives (domaines Capside CA et Matrice MA de Gag du FIV). L’étude structurale de ces protéines et leur compréhension fonctionnelle au sein de l’hôte pourront à l’avenir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques et/ou vaccinales contre les lentivirus, palliant ainsi les problèmes existants de résistances virales / Since its discovery 30 years ago, the Human Immunodeficiency Virus is the cause of an important mortality worldwide. Because of the difficulty to test the efficiency of therapeutical and/or vaccinal formulations directly in humans, studies of models of HIV infections, such as the Feline Immunodeficiency Virus (FIV), have been performed in recent years. In addition to its veterinary interest, the study of FIV is an important issue to find a way to control infections by lentiviruses such as HIV. It can help to develop and test the efficiency of specific therapies and/or vaccines for cats, where AIDS mimics the symptoms and hematologic changes observed in humans. This manuscript describes the structural study of two types of viral proteins of these viruses, early lentiviral proteins (HIV Tat protein) and late lentiviral proteins (CA capsid and MA Matrix domains of FIV Gag). The structural study of these proteins and their functional understanding into the host will open new therapeutic and/or vaccine strategies against these lentiviruses in the future, in order to overcome the existing problems of viral resistance