Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’hématopoïèse est un processus complexe et extrêmement régulé qui permet la production de l’ensemble des cellules sanguines à partir de cellules souches. Différents acteurs interviennent dans cette régulation et une altération de l’un ou plusieurs de ces régulateurs est souvent à l’origine de leucémies. L’un des acteurs majeurs de cette régulation est le complexe Core Binding Factor (CBF), particulièrement touché dans ces hémopathies. Ce facteur de transcription se compose de la sous-unité CBFβ et d’une sous unité variable RUNX, (habituellement RUNX1 dans l’hématopoïèse). Dans la leucémie aiguë myéloïde 4 à composante éosinophile (LAM4 Eo), le gène CBFβ est retrouvé fusionné au gène MYH11, entraînant la formation d’un gène chimérique codant pour l’oncoprotéine de fusion CBFβ–SMMHC. Cette version altérée du complexe CBF a pour caractéristique de séquestrer RUNX1 dans le cytoplasme et de déréguler l’expression des gènes cible du complexe via diverses mécanismes. Elle est en effet capable d’inhiber l’expression génique par le recrutement d’inhibiteurs transcriptionnels mais a également récemment été décrite comme liée au promoteur de gènes actifs. Ces dérégulations entraînent une altération de la différenciation et/ou une apoptose chez différents progéniteurs hématopoïétiques via divers mécanismes particulièrement étudiés chez la souris. Chez l’homme, les processus oncogéniques par lesquels CBFβ–SMMHC altère la différenciation et induit la leucémogénèse restent cependant peu décrits. Au moyen de deux modèles humains : une lignée ME-1 inductible pour l’inhibition de l’expression de l’oncoprotéine et des blastes leucémiques de patients atteints de LAM4 Eo dérivés de xénogreffes murines, nous avons découvert un nouveau composant cellulaire dérégulé par CBFβ–SMMHC ainsi qu’un nouveau partenaire d’interaction. En effet, dans un premier temps, ce travail révèle que l’oncoprotéine a des effets complexes sur la biogenèse des ribosomes aux niveaux génomique et post-transcriptionnel. Nous avons montré que CBFβ–SMMHC fixe le promoteur des gènes ribosomiques et active leur transcription. Nous avons également observé un niveau d’expression de ces gènes, supérieur dans les LAM dites de type CBFβ–SMMHC comparées aux autres sous-groupes de LAM. Dans la lignée ME-1 cette activation de la transcription ne se traduit cependant pas par une augmentation du contenu cellulaire en ribosomes, expliqué en partie par une maturation du précurseur des ARN ribosomiques moins efficiente en présence de l’oncoprotéine. Dans un second temps nous avons observé que CBFβ–SMMHC interagit directement avec la protéine Polycomb RING1B et BMI1 sous-unité du complexe de répression des gènes PRC1. L’inhibition de CBFβ–SMMHC entraînant une augmentation du niveau de fixation globale de RING1B sur l’ensemble du génome. Nous pensons que de cette altération du niveau de fixation de RING1B induite par CBFβ–SMMHC, découle la dérégulation de nombreux gènes impliqués dans diverses voies ou mécanismes critiques de l’hématopoïèse. Nous avons ainsi mis en lumière deux nouveaux mécanismes oncogéniques médiés par l’oncoprotéine CBFβ–SMMHC ouvrant de nouveaux horizons pour de potentielles cibles thérapeutiques. / Haematopoiesis is a complex process allowing the production of all mature blood cells from stem cells. This process is highly regulated at the transcriptional level, and perturbation of normal transcriptional regulation may cause leukaemia. One of the major actors of this regulation is the Core Binding factor (CBF) complex, which is frequently subject to genetic alteration in leukaemia. This transcription factor consists of a constant CBFβ subunit and a variable RUNX subunit, usually RUNX1 in haematopoiesis. In acute myeloid leukemia 4 with eosinophilic component (AMLM4 Eo), the CBFβ gene is fused to the MYH11 gene, leading to the formation of a chimeric gene encoding the CBFβ–SMMHC oncoprotein. This altered version of the CBF complex sequesters RUNX1 into the cytoplasm, and deregulates wild type CBF target gene expression though diverse mechanisms. While CBFβ–SMMHC can inhibit gene expression by recruiting transcriptional inhibitors, it has also recently been described to bind and activate certain gene promoters. The mechanisms by which these deregulations lead to an alteration of the differentiation and/or an apoptosis of diverse hematopoietic progenitors is best characterised in murine models. In humans, the oncogenic processes by which CBFβ–SMMHC alters differentiation and induces leukaemogenesis remain unclear. Using two human cellular models, namely (i) an ME-1 cell line containing an inducible shRNA directed against the CBFβ- MYH11 fusion transcript and (ii) Patient-derived AML M4Eo murine xenografts, we describe two novel activities of CBFβ–SMMHC. Firstly, we discovered that the oncoprotein has complex effects on ribosome biogenesis at both the genomic and post-transcriptomic levels. We found that CBFβ–SMMHC binds ribosomal gene promoters and activates their transcription, which was corroborated by the observation of higher ribosomal gene expression in human AML M4Eo, compared with other AML subgroups. In the ME-1 cell line this transcriptional activation did not lead to the higher cellular ribosome content, which was explained in part by decreased efficiency of ribosomal RNA maturation in the presence of the oncoprotein. Secondly, we found that CBFβ–SMMHC interacts directly with RING1B and BMI1 protein subunit of the Polycomb gene repression complex PRC1. Depletion of CBFβ–SMMHC lead to increased global binding of RING1B to the genome, resulting in deregulation of numerous genes that are critical for normal haematopoietic differentiation. We have therefore highlighted two new oncogenic mechanisms mediated by the CBFβ–SMMHC oncoprotein, therefore opening new avenues to investigate potential therapeutic targets.

Des mutations du gène Ras jouent un rôle essentiel dans le développement tumoral. Les GTPases Ral , RalA et RalB, sont des effecteurs proximaux de l’oncogène Ras. RalA permet la croissance en absence de substrat et RalB est nécessaire à l'autophagie et à la résistance à l'apoptose des cellules cancéreuses. Cette thèse a pour objectif de clarifier les mécanismes moléculaires de la signalisation Ral impliqués dans l’oncogenèse dépendante des protéines Ras.Des criblages par double hydride ont été effectués par notre équipe et un interactome de Ral a été établi. Ce criblage a montré une interaction entre des protéines de la signalisation Ral et la protéine NDR1, une kinase pro-apoptotique appartenant à la voie " suppresseur de tumeur" Hippo. Le Projet 1 montre la régulation de NDR1 par la voie RalA-Exocyste- MAP4K4 en réponse au stress osmotique, oxydatif ou au traitement par le TNF-α. Dans cette voie, la kinase MAP4K4, un effecteur de RalA, via le complexe exocyste active directement NDR1. En outre, nous avons montré que la voie RalA-MAP4K4-NDR1 était nécessaire à l'apoptose déclenchée par le TNF-α ou par la surexpression de RASSF1A, suppresseur de tumeur appartenant à la voie Hippo. Nous avons donc montré que RalA a un rôle pro-apoptotique inattendue qui agit via la kinase NDR1, en plus de son rôle connu de proto-oncogène en aval de Ras.Le projet 2 montre que la protéine kinase NDR1 est un régulateur de l'autophagie. Des criblages par double hydride ont été effectués par notre équipe avec NDR1 comme appât et ont permis de montrer une interaction entre Beclin 1, une protéine majeure de l’autophagie, et NDR1. Nous avons montré que NDR1 était nécessaire à l'autophagie et à la formation des autophagosomes chez l'humain et la Drosophile. De plus, NDR1 est nécessaire à la formation du complexe Exo84 de l'exocyste, Beclin1 et RalB nécessaire à l'initiation de l'autophagie. Nous montrons également que RalB régule l'état d'activation de NDR 1 après induction de l'autophagie. En effet, en absence de RalB, nous avons observé une hyper - activation de NDR1 menant les cellules vers l'apoptose. Ainsi nous avons montré que NDR1 joue le rôle d'interrupteur favorisant l'autophagie ou favorisant l'apoptose suivant son état d'activation.Le projet 3 étudie l'implication de la voie RalGTPases-NDR1 dans l'oncogenèse dépendante de Ras et dissèque par quels mécanismes NDR1 y contribue. / Constitutive Ras signalling is one of the most frequent oncogenic event in human cancers. Thus, it is imperative to identify new therapeutic options targeting downstream effectors of Ras signalling. Ras-like GTPases RalA and RalB are proximal effectors of oncogenic Ras. RalA was reported to support anchorage independent proliferation and RalB regulates autophagy and inhibits apoptosis of cancer cells. Ral proteins execute these functions via several direct effectors as the exocyst, an octameric complex originally identified as regulator of vesicles trafficking. The global goal of this PhD was to better decipher the molecular mechanisms underlying the functions of Ral GTPases in oncogenesis.To extend the Ral interactome, i.e. the protein-protein interaction network centered on Ral, we performed yeast-two hybrid screenings which led to the identification of the NDR1 kinase, belonging to the tumor suppressor Hippo pathway. NDR1 functions in oncogenesis were investigated in the context of three projects.In Project 1, we showed that NDR1-dependent apoptosis is regulated by a RalA/Exocyst/MAP4K4/NDR1 cascade. We reported that under osmotic or oxidative stresses or TNF-α treatment, the Ste20-like MAP4K4 kinase, an effector of RalA via the exocyst complex, directly activates NDR1. Moreover, we found that TNF-α treatment or overexpression of the tumor suppressor RASSF1A, which belongs to the Hippo pathway, leads to apoptosis through this RalA/Exocyst/MAP4K4/NDR1 pathway. This novel and unexpected pro-apoptotic role of RalA suggests that the RalA GTPase can positively signal in tumor suppressor pathways via the kinase NDR1, in addition to its proto-oncogenic role downstream of Ras. In Project 2, we described the NDR1 protein kinase as a conserved regulator of autophagy. Using NDR1 as bait in yeast two hybrid screens, we fished Beclin1, a key regulator of autophagy, and we validated the existence of a direct biochemical NDR1-Beclin1 interaction. We showed that NDR1promotes autophagosome formation in human cells and Drosophila larvae. Furthermore, we observed that NDR1 supports the interaction of the exocyst component Exo84 with Beclin1 and RalB, which is required to initiate autophagosome formation. Very interestingly, under prolonged autophagy, RalB depletion triggers hyperactivation of NDR1 resulting in NDR1-dependent apoptosis. Thus, it appears that the NDR1 kinase could act as a switch between autophagy (=survival) or apoptosis (=death), under the control of RalB. In Project 3, we addressed the role of the newly identified RalGTPases-NDR1axis in Ras - induced oncogenesis and tumorigenesis.

Le mélanome est un cancer de la peau agressif et au mauvais pronostic. Si de nouvelles solutions thérapeutiques efficaces ont été développées, les taux de réponses sont variables et transitoires. Découvrir de nouveaux mécanismes oncogéniques dans cette pathologie reste donc nécessaire. Durant mes travaux, j’ai pu démontrer que la protéine tyrosine-kinase FES est exprimée dans les mélanocytes normaux. Cette expression est largement perdue dans un panel de lignées cellulaires de mélanome, au niveau protéique et transcriptionnel ainsi que dans des cultures primaires d’échantillons de patients. La perte de FES est due à une hyper-méthylation de son promoteur et est réversible. En ré-exprimant FES de manière stable dans deux lignées cellulaires de mélanomes, j’ai montré que cette réexpression entraînait une diminution des capacités oncogéniques des cellules. De plus, en analysant les données d’une cohorte de mélanomes (TCGA), j’ai pu établir qu’une diminution importante ou une perte d’expression de FES se retrouve dans près de 40% des patients, et qu’elle est corrélée à une hyper-méthylation du gène FES. Les patients ayant une faible expression de FES présentent un moins bon pronostic soulignant l’importance de ce phénomène. Enfin, en croisant un modèle murin déficient pour le gène Fes avec un modèle de mélanome, nous observons que les tumeurs sous fond Fes KO sont plus prolifératives et plus volumineuses.Ainsi, par des analyses in vitro, sur des données de patients ou en croisant des modèles murins, j’ai pu démontrer que FES est exprimée au niveau des mélanocytes normaux et y exerce un rôle de suppresseur de tumeur. / Among skin cancers, melanoma is the most aggressive and has the worst prognosis. In the last years, new therapeutic tools have been developed but responses differ between patients and are often transient due to resistance mechanisms. This highlights the need to improve understanding of molecular mechanisms of the disease. During my thesis, I have shown for the first time that FES tyrosine kinase is expressed in normal melanocytes, and that its expression is lost at the protein and RNA levels in most melanoma cell lines. The same result is observed in a panel of 12 patients’ short-term cultures. The lack of expression is due to FES promoter hyper-methylation and can be reverted using a hypomethylating agent. By restoring FES expression in two melanoma cell lines, I observe a decrease of oncogenic properties of the cells. Moreover, the analysis of the TCGA data on melanoma indicate that FES expression is strongly decreased or lost in about 40% of patients, and that this loss of expression is correlated with FES promoter methylation. Importantly, patients with low level of FES mRNA have poor prognosis compared to FES expressing patients. Finally, Fes knock-out mice crossed with an inducible melanoma mouse model indicate that tumors proliferation and size are more important under a Fes KO background.In conclusion, by using melanoma cells in vitro, data from melanoma patients and mouse models, I have demonstrated that FES is expressed in normal melanocytes and clearly plays a tumor suppressor role.in melanoma.

Le virus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) code pour un cluster de 12 précurseurs de micro (mi)ARN abondamment exprimés pendant les phases lytiques et latentes de l’infection. Des études précédentes ont rapporté que KSHV est capable d’inhiber l’apoptose pendant l’infection latente ; nous avons donc testé si les miARN du virus étaient impliqués dans ce processus. Nous avons trouvé que des cellules HEK293 et DG-75 exprimant de manière stable les miARN de KSHV étaient protégées de l’apoptose. Les cibles cellulaires potentielles qui étaient significativement négativement régulées lors de l’expression des miARNs de KSHV ont été identifiées par analyse transcriptomique par microarray. Parmi celles-ci, nous avons validé par tests rapporteurs luciférase, PCR quantitative, et western blot, Caspase 3 (CASP3), un facteur jouant un rôle critique dans le contrôle de l’apoptose. Via le biais de mutagenèse dirigée, nous avons montré que trois miARN de KSHV, miR- 12-1, 3 et 4-3p, étaient responsables du ciblage de CASP3. L’inhibition spécifique de ces miARN dans des cellules infectées par KSHV a résulté en une augmentation des niveaux d’expression de CASP3 endogène, et en une apoptose plus accrue. Vus dans leur ensemble, nos résultats suggèrent que les miARN de KSHV participent directement à l’inhibition précédemment rapportée de l’apoptose par le virus, et donc qu’ils jouent probablement un rôle dans l’oncogenèse induite par KSHV. / Kaposi’s sarcoma herpesvirus (KSHV) encodes a cluster of twelve micro (mi)RNA precursors, which are abundantly expressed during both latent and lytic infection. Previous studies reported that KSHV is able to inhibit apoptosis; we thus tested the involvement of viral miRNAs in this process. We found that both HEK293 epithelial cells and DG-75 cells stably expressing KSHV miRNAs were protected from apoptosis. Potential cellular targets that were significantly down-regulated upon KSHV miRNAs expression were identified by microarray profiling. Among them, we validated by luciferase reporter assays, quantitative PCR and western blotting Caspase 3 (CASP3), a critical factor for the control of apoptosis. Using site-directed mutagenesis, we found that three KSHV miRNAs, miR-K12-1, 3 and 4-3p, were responsible for the targeting of CASP3. Specific inhibition of these miRNAs in KSHV infected cells resulted in increased expression levels of endogenous CASP3 and enhanced apoptosis. Altogether, our results suggest that KSHV miRNAs directly participate to the previously reported inhibition of apoptosis by the virus, and are thus likely to play a role in KSHV-induced oncogenesis.

Notre génome subit constamment les effets néfastes des agents endommageant de l'ADN. Afin de se protéger de ces effets délétères, les cellules disposent d’un système de détection des dommages à l’ADN (point de contrôle ou « checkpoint »). Certaines lésions peuvent persister quand les cellules entrent en phase S et inhiber ainsi la synthèse de l’ADN en interférant avec les ADN polymérases réplicatives. Ceci peut provoquer des arrêts prolongés des fourches de réplication ce qui fragilise l’ADN. Pour préserver l’intégrité de l’information génétique, les cellules ont développé une voie de tolérance qui implique des ADN polymérases spécialisées dans la réplication des lésions, appelées ADN Polymérases translésionnelles (Pols TLS). Dans ce processus, PCNA joue le rôle de facteur d’échafaudage pour de nombreuses protéines impliquées dans le métabolisme de l'ADN. Les mécanismes de régulation des échanges entre les différents partenaires de PCNA ne sont pas très bien compris. Parmi les protéines qui interagissent avec PCNA, CDT1, p21 ou encore PR-Set7/Set8 sont caractérisées par une forte affinité pour cette protéine. Ces dernières possèdent un motif d’interaction particulier avec PCNA, nommé « PIP degron », qui favorise leur protéolyse d'une manière dépendante de l’E3 ubiquitine ligase CRL4Cdt2. Après irradiation aux UV-C, le facteur d’initiation de la réplication CDT1 est rapidement détruit d’une manière dépendante de son PIP degron, Dans la première partie de mon travail, j’ai contribué à comprendre le rôle fonctionnel de cette dégradation. Les résultats obtenus ont fourni des évidences expérimentales qui montrent que l’inhibition de la dégradation de CDT1 par CRL4Cdt2 dans les cellules de mammifères compromet la relocalisation des TLS Pol eta et Pol kappaen foyers nucléaires induits par les irradiations UV-C. On a constaté que seules les protéines qui contiennent un PIP degron interfèrent avec la formation de foyers de Pol eta. La mutagenèse du PIP degron de CDT1 a révélé qu'un résidu de thréonine conservé parmi les PIP degrons est essentiel pour l'inhibition de la formation des foyers des TLS Polymérases. Les résultats obtenus suggèrent que l’élimination de protéines contenant des PIP degrons par la voie CRL4Cdt2 régule le recrutement de TLS Polymérases au niveau des sites des dommages induits par les UV-C.Dans un second temps, on s’est intéressé à l’étude du checkpoint des dommages à l’ADN au cours de l’embryogénèse. En effet, dans les embryons précoces, le checkpoint est silencieux jusqu'à la transition de mid-blastula (MBT), en raison de facteurs maternels limitants. Dans ce travail, nous avons montré, aussi bien in vitro qu’in vivo, que l’ubiquitine ligase de type E3 RAD18, un régulateur majeur de la translésion, est un facteur limitant pour l’activation du checkpoint dans les embryons de xénope. Nous avons montré que l'inactivation de la fonction de l’ubiquitine ligase RAD18 conduit à l'activation du checkpoint par un mécanisme qui implique l’arrêt des fourches de réplication en face des lésions produites par les UV-C. De plus, nous avons montré que l'abondance de RAD18 et de PCNA monoubiquitiné (PCNAmUb) est régulée au cours de l’embryogénèse. À l’approche de la MBT, l’abondance de l'ADN limite la disponibilité de RAD18, réduisant ainsi la quantité de PCNAmUb et induisant la dé-répression du checkpoint. En outre, nous avons montré que cette régulation embryonnaire peut être réactivée dans les cellules somatiques de mammifères par l'expression ectopique de RAD18, conférant une résistance aux agents qui causent des dommages à l'ADN. Enfin, nous avons trouvé que l'expression de RAD18 est élevée dans les cellules souches cancéreuses de glioblastome hautement résistantes aux dommages de l'ADN. En somme, ces données proposent RAD18 comme un facteur embryonnaire critique qui inhibe le point de contrôle des dommages de l’ADN et suggèrent que le dérèglement de l’expression de RAD18 peut avoir un potentiel oncogénique inattendu / Our genome is continuously exposed to DNA damaging agents. In order to preserve the integrity of their genome, cells have evolved a DNA damage signalling pathway known as checkpoint. Some lesions may persist when cells enter the S-phase and halt the progression of replicative DNA polymerases. This can cause prolonged replication forks stalling which threaten the stability of the genome. To preserve the integrity of genetic information, cells have developed a tolerance pathway which involves specialized DNA polymerases, called translesion DNA polymerases (TLS Pols). These polymerases have the unique ability to accommodate the damaged bases thanks to their catalytic site. In this process, PCNA acts as a scaffold for many proteins involved in DNA metabolism. The mechanisms governing the exchanges between different PCNA partners are not well understood. Among the proteins that interact with PCNA, CDT1, p21 and PR-Set7/set8 are characterized by a high binding affinity. These proteins have a particular interaction domain with PCNA, called "PIP degron", which promotes their proteasomal degradation via the E3 ubiquitin ligase CRL4Cdt2. After UV-C irradiation, the replication initiation factor CDT1 is rapidly degraded in a PIP degron-dependent manner. During the first part of my work, we wanted to understand the functional role of this degradation. Our results have shown that inhibition of CDT1 degradation by CRL4Cdt2 in mammalian cells, compromises the relocalisation of TLS Pol eta and Pol kappato nuclear foci after UV-C irradiation. We also found that only the proteins which contain a PIP degron interfere with the formation of Pol eta foci. Mutagenesis experiments on CDT1 PIP degron revealed that a threonine residue conserved among PIP degrons is essential for inhibiting foci formation of at least two TLS polymerases. This results suggest that CRL4Cdt2-dependent degradation of proteins containing PIP degrons regulates the recruitment of TLS polymerases at sites of UV-induced DNA damage.During the second part of my thesis, we studied DNA damage checkpoint regulation during embryogenesis. Indeed, in early embryos, the DNA damage checkpoint is silent until the mid-blastula transition (MBT) due to maternal inhibiting factors. In this work, we have shown, both in vitro and in vivo, that the E3 ubiquitin ligase RAD18, a major regulator of translesion DNA synthesis, is a limiting factor for the checkpoint activation in Xenopus embryos. We have also shown that RAD18 depletion leads to the activation of DNA damage checkpoints by inducing replication fork uncoupling in front of the lesions. Furthermore, we showed that the abundance of RAD18 and PCNA monoubiquitination (PCNAmUb) is regulated during embryonic development. Near the MBT, the increased abundance of DNA limits the availability of RAD18, thereby reducing the amount of PCNAmUb and inducing the de-repression of the checkpoint. Moreover, we have shown that this embryonic-like regulation can be reactivated in somatic mammalian cells by ectopic expression of RAD18, conferring resistance to DNA damaging. Finally, we found high RAD18 levels in glioblastoma cancer stem cells highly resistant to DNA damage. All together, these data propose RAD18 as a critical factor that inhibits DNA damage checkpoint in early embryos and suggests that dysregulation of RAD18 expression may have an unexpected oncogenic potential

Les lymphomes cutanés primitifs B comprennent 2 formes indolentes (lymphomes des centres folliculaires et de la zone marginale) et une forme clinique agressive, le lymphome B diffus à grandes cellules de type jambe. Si le lymphome des centres folliculaires ne présente le plus souvent pas la translocation t(14;18) à l'origine d'une dérégulation de BCL2 caractéristique des lymphomes folliculaires ganglionnaires, elle peut être identifiée en FISH dans 8,7% des cas et représenter un risque d'extension extra-cutanée. En revanche, l'étude de l'oncogenèse des lymphomes B de type jambe révèle des mécanismes communs d'oncogenèse avec les lymphomes B diffus à grandes cellules ganglionnaires, avec une répartition différente des altérations. Notamment, la mutation du gène MYD88L265P qui encode une protéine adaptatrice de la voie des Toll-like récepteurs responsable de l'activation constitutive de la voie NFκB, est très fréquemment observée (69% des cas) et est associée à une survie spécifique plus courte. De plus, contrairement aux autres lymphomes cutanés B, les cellules tumorales sont porteuses de multiples anomalies comme des translocations ou des délétions. D'autres arguments issus de l'analyse des séquences des gènes des immunoglobulines nous permettent de présumer que la cellule d'origine est un lymphocyte B mature, post-centre germinatif. Le fort taux de mutations identifiées reflète l'hypermutation somatique acquise à l'occasion du passage par le centre germinatif, mais l'expression d'un isotype primaire d'anticorps (IgM) suggère un blocage de la différentiation plasmocytaire terminale notamment pour la commutation isotypique. / Cutaneous B-cell lymphomas are represented by indolent B-cell lymphomas (follicle center and marginal zone), and primary cutaneous diffuse large B-cell lymphoma, leg-type which is characterized by an aggressive behavior. Primary cutaneous follicle center lymphoma usually do not harbor the t(14;18) translocation, which is characteristic of nodal follicular lymphoma and conduct to BCL2 overexpression. However, it can be observed by FISH in 8.7% of cutaneous cases and seems to be associated with extra-cutaneous disease. In contrast, primary cutaneous diffuse large B-cell lymphoma, leg-type shows common genetic alterations with its nodal counterpart diffuse large B-cell lymphoma, suggestive of common oncogenesis pathways, with distinct frequencies and repartition ofmutations. Especially, the MYD88L265P mutation that encodes an important adaptator protein of the Toll-like receptor pathway, activating NFκB, is very frequent (69% of cases) and associated with a shorter specific survival. Moreover, contrary to indolent primary cutaneous B-cell lymphoma, tumour cells often harbor multiple genetic alterations such as translocations and deletions. The analysis of the immunoglobulin genes sequences led us to suppose that the cell of origin could be a post germinal-center mature B-cell. Highly mutated sequences are the reflection of the germinal center passage, but IgM expression suggests a terminal differentiation blockage, notably with a class switch recombination defect.

La télomérase, composée de l‘ARN TR et de la protéine TERT, responsable du maintien de la longueur des télomères est surexprimée dans la majorité des cellules cancéreuses. La dynamique de la régulation post-transcriptionnelle de TERT sur l‘activation de la télomérase a été étudiée dans le modèle de lymphomagenèse induite par l‘herpesvirus oncogène aviaire de la maladie de Marek. L‘augmentation de l‘activité télomérase des TCD4+ lors de l‘apparition des lymphomes résulte d‘une hausse du transcrit constitutif et de celle des transcrits cibles de la voie de dégradation du « non-sense mediated decay » (NMD) alors que l‘activité télomérase basale des TCD4+ non infectés est contrôlée par les isoformes dominantes négatives. La caractérisation de la protéine virale ICP27 de MDV-1, régulateur potentiel de l‘épissage des gènes, qui s‘exprime pendant la phase de réplication lytique du virus a complété cette étude. ICP27 est capable de co-localiser et d‘interagir avec les protéines SR du splicéosome ainsi que de réguler négativement l‘épissage des gènes cellulaire TERT et viral vIL8 de manière similaire à ICP27 de l‘herpesvirus simplex 1. Le modèle naturel de lymphomagenèse induite par MDV-1 a permis d‘établir pour la première fois un lien entre l‘activation de la télomérase in vivo et la régulation de l‘épissage de TERT, à laquelle pourrait participer la protéine virale ICP27. / The telomerase, consisting of an RNA template (TR) and a reverse transcriptase (TERT) maintains telomere length and is highly expressed in the majority of cancer cells. The splicing regulation of TERT was studied in Marek‘s disease (MD), a natural lymphoma induced by MDV-1, the avian MD herpesvirus. Telomerase activation observed in TCD4+ cells at the onset of MD lymphoma was due to an increase of constitutively spliced and « non-sense mediated decay » (NMD) while basal telomerase activity of non infected TCD4+ cells was controlled by dominant negative isoforms. In addition, the viral protein ICP27, a putative regulator of splicing, expressed during MDV-1 lytic infection was characterised. ICP27 co-localized and interacted with spliceosome SR proteins and negatively controlled splicing of TERT and vIL8 viral gene in a way similar to that of ICP27 of herpesvirus simplex 1. The MD model provides the only data on the in vivo regulation of TERT splicing, possibly mediated by ICP27, and telomerase activation during lymphomagenesis induced by a herpesvirus in its natural host.

Les enzymes de la famille Ten-Eleven-Translocation (TET) sont des oxygénases dépendantes du 2-oxoglutarate et du Fe (II) capables d’hydroxyler les cytosines méthylées. La conversion en 5-hydroxyméthylcytosines constituerait une étape vers la déméthylation et les protéines TET seraient donc impliquées dans le contrôle épigénétique de la transcription. Des mutations inactivatrices acquises du gène TET2 ont été décrites dans environ 20% des hémopathies myéloïdes humaines. L'analyse de deux modèles murins d’invalidation de Tet2 montre que Tet2 contrôle l'hydroxyméthylation et l’homéostasie du compartiment hématopoïétique. Son inactivation entraine des anomalies pléiotropiques des stades précoces et tardifs de l’hématopoïèse et le développement d'hémopathies myéloïdes. L'étude du statut de TET2 chez une grande série de patients porteurs d'hémopathies lymphoïdes matures retrouve des mutations de ce gène chez 12% des cas de lymphomes T. Celles-ci sont significativement associées aux mutations du gène DNMT3A et sont plus fréquemment observées au sein de deux sous-types, le lymphome T angio-immunoblastique et le lymphome T périphérique non spécifié. L’analyse de populations triées montre la préexistence des mutations de TET2 ou de DNMT3A dans les progéniteurs hématopoïétiques chez certains patients.En conclusion, les mutations de TET2 peuvent survenir dans des progéniteurs précoces, leur conférer un avantage sélectif par rapport aux progéniteurs sauvages et conduire au développement d’une hématopoïèse clonale. Des anomalies génétiques additionnelles semblent nécessaires à la transformation tumorale aussi bien myéloïde que lymphoïde. Ces deux types d’hémopathies pourraient donc se développer à partir d’une même atteinte du compartiment des cellules souches hématopoïétiques. / The Ten-Eleven-Translocation (TET) enzymes belong to a family of oxygenases that are dependent on 2-oxoglutarate and Fe (II) and are able to oxidize methylcytosines. This may represent a step toward DNA demethylation and as such these proteins are involved in the epigenetic control of transcription. Acquired TET2 loss-of-function mutations have been reported in about 20% of human myeloid malignancies.Analysis of two Tet2-deficiency mouse models shows that Tet2 controls hydroxymethylation and homeostasis in the hematopoietic compartment. Tet2 deficiency results in pleiotropic abnormalities of both early and late steps of hematopoiesis and leads to the development of myeloid disorders. The sequencing of TET2 in a large series of patients with mature lymphoproliferations identifies TET2 mutations in 12% of T-cell lymphoma. They are significantly associated with DNMT3A mutations and are more frequently observed in two subtypes, the angioimmunoblastic T-cell lymphoma and the peripheral T-cell lymphoma, not other specified. Analysis of flow-sorted populations shows the presence of TET2 and DNMT3A alterations in hematopoietic progenitors in some patients. In summary, TET2 mutations may affect early progenitors, confer a selective advantage compared with controls progenitors and result in a clonal hematopoiesis. Some additional genetic events are likely required to the myeloid or lymphoid transformation. Both diseases could therefore arise from a common alteration of the hematopoietic stem cell compartment.

Les enzymes de la famille Ten-Eleven-Translocation (TET) sont des oxygénases dépendantes du 2-oxoglutarate et du Fe (II) capables d'hydroxyler les cytosines méthylées. La conversion en 5-hydroxyméthylcytosines constituerait une étape vers la déméthylation et les protéines TET seraient donc impliquées dans le contrôle épigénétique de la transcription. Des mutations inactivatrices acquises du gène TET2 ont été décrites dans environ 20% des hémopathies myéloïdes humaines. L'analyse de deux modèles murins d'invalidation de Tet2 montre que Tet2 contrôle l'hydroxyméthylation et l'homéostasie du compartiment hématopoïétique. Son inactivation entraine des anomalies pléiotropiques des stades précoces et tardifs de l'hématopoïèse et le développement d'hémopathies myéloïdes. L'étude du statut de TET2 chez une grande série de patients porteurs d'hémopathies lymphoïdes matures retrouve des mutations de ce gène chez 12% des cas de lymphomes T. Celles-ci sont significativement associées aux mutations du gène DNMT3A et sont plus fréquemment observées au sein de deux sous-types, le lymphome T angio-immunoblastique et le lymphome T périphérique non spécifié. L'analyse de populations triées montre la préexistence des mutations de TET2 ou de DNMT3A dans les progéniteurs hématopoïétiques chez certains patients.En conclusion, les mutations de TET2 peuvent survenir dans des progéniteurs précoces, leur conférer un avantage sélectif par rapport aux progéniteurs sauvages et conduire au développement d'une hématopoïèse clonale. Des anomalies génétiques additionnelles semblent nécessaires à la transformation tumorale aussi bien myéloïde que lymphoïde. Ces deux types d'hémopathies pourraient donc se développer à partir d'une même atteinte du compartiment des cellules souches hématopoïétiques.