Le neuroblastome est cancer du jeune enfant se développant au sein du système nerveux périphérique sympathique. Cette tumeur est caractérisée par sa grande hétérogénéité clinique : allant de formes régressant spontanément aux tumeurs de haut-risque, réfractaires aux traitements les plus agressifs. La survie à long terme des patients présentant un neuroblastome de haut-risque reste par ailleurs inférieure à 50%, ce qui souligne la nécessité de trouver de nouveaux traitements afin d’améliorer leur prise en charge thérapeutique.Récemment, en définissant le paysage épigénétique des cellules de neuroblastome, nous avons observé la présence de super-enhancers (SE). La caractérisation du paysage des SE dans les lignées de neuroblastome nous a permis de révéler l’hétérogénéité cellulaire du neuroblastome, composée de deux identités distinctes : noradrénergique et mésenchymateuse. Chacune des identités cellulaires est caractérisée par un circuit de régulation transcriptionnelle (CRC) : les facteurs PHOX2B, HAND2 et GATA3 définissent l’identité noradrénergique alors que les facteurs de la famille AP-1 gouvernent l’identité mésenchymateuse. Nous avons par ailleurs montré la différence de sensibilité aux chimiothérapies classiquement utilisées en clinique entre ces deux types cellulaires, avec une résistance accrue des cellules mésenchymateuses.Mon travail de thèse porte sur la caractérisation du rôle des facteurs de transcription PHOX2B et GATA3 dans l’établissement et le maintien de l’identité noradrénergique des cellules de neuroblastome. J’ai réalisé leur knock-out par CRISPR-Cas9 dans la lignée noradrénergique SH-SY5Y. L’inactivation de PHOX2B ne modifie ni le programme transcriptionnel ni le phénotype des cellules, arborant une identité noradrénergique. En revanche, les cellules inactivées pour GATA3 possèdent un phénotype cellulaire mésenchymateux ainsi que des capacités de migration, d’invasion et de résistance aux chimiothérapies. Le knock-out de PHOX2B et GATA3 entraine une diminution de la prolifération cellulaire, traduisant le phénomène d’addiction transcriptionnelle des cellules cancéreuses. La caractérisation du paysage épigénétique des cellules inactivées pour GATA3 démontre leur reprogrammation de l’identité noradrénergique vers l’identité mésenchymateuse avec l’effondrement des SE noradrénergiques ainsi que l’acquisition de SE mésenchymateux. GATA3 est donc indispensable pour le maintien de l’identité noradrénergique in vitro.Les résultats générés lors de ma thèse montrent que les facteurs de transcription impliqués dans un même CRC possèdent des rôles distincts dans l’identité cellulaire. La caractérisation de la dynamique de reprogrammation ainsi que des facteurs impliqués dans ce processus nous permettrons de mieux comprendre les phénomènes de plasticité cellulaire à l’origine de la progression tumorale et de la rechute thérapeutique des patients. / Neuroblastoma is a pediatric tumor of the peripheral sympathetic nervous system characterized by its diversity of clinical presentations from spontaneous regression to highly aggressive tumors. Currently, the overall survival of high-risk neuroblastoma patients remains under 50% which highlight the need to find new therapeutic approaches to improve patient outcome.Recently, we defined the epigenetic landscape of neuroblastoma cell lines and observed the presence of super-enhancers (SE). The characterization of the SE landscape let us to define the heterogeneity of neuroblastoma cell identity with the presence of noradrenergic and mesenchymal cells. Both cell identities are governed by a core regulatory circuitry (CRC), composed by PHOX2B-HAND2-GATA3 in the noradrenergic cells and by AP-1 transcription factors in the mesenchymal cells. We also demonstrate the different behaviors of the cells regarding chemotherapy treatments with a higher resistance of the mesenchymal cells.My thesis aimed at deciphering the role of PHOX2B and GATA3 transcription factors in the establishment and the maintenance of the noradrenergic identity of neuroblastoma cells. To do this, PHOX2B and GATA3 were knock-out by CRISPR-Cas9 in the noradrenergic SH-SY5Y cell line. PHOX2B knock-out has no major impact neither on the transcriptomic profile nor the phenotype of the cells. PHOX2B knock-out cells still maintain their noradrenergic identity. In contrast, GATA3 knock-out cells harbor a mesenchymal phenotype showing higher ability to migrate, invade and being pore resistant to chemotherapy than control SH-SY5Y cells. Both PHOX2B and GATA3 knock-out decrease the SH-SY5Y cell proliferation in vitro and in vivo, which highlight the transcriptional dependency of the noradrenergic cells for their identity-related transcription factors. The characterization of the epigenetic landscape of GATA3 knock-out cells revealed their reprograming from the noradrenergic to the mesenchymal identity with the loss of noradrenergic SE and the acquisition of mesenchymal SE. These results demonstrate that GATA3 is essential for the maintenance of the noradrenergic identity in vitro.Altogether, these results show that transcription factors involved in a CRC can have distinct role in the cell identity. The characterization of the reprogramming dynamics as well as the factors involved in this process will allow us to better understand the cellular plasticity involved in the tumor progression and patient relapse.

L’activation constitutive de la voie NF-κB est une étape cruciale dans le processus de transformation des lymphocytes T par le virus humain T-lymphotrope de type 1 (HTLV-1). La protéine virale Tax y joue un rôle majeur en recrutant la protéine régulatrice IKKγ. De précédents travaux effectués par notre équipe ont montré que l’activation de la voie NF-κB parTax est promue par le recrutement des facteurs celluaires Optineurine (OPTN) et Tax1-binding protein 1 (TAX1BP1), deux protéines récemment décrites comme des membres de la famille de récepteurs autophagiques Sequestosome-Like Receptors (SLR), posant la question des liens fonctionnels entre la signalisation NF-κB et la machinerie autophagique.Notre étude décrit l’interaction de Tax avec le récepteur p62, autre membre de la famille des SLR. L’interaction est directe et indépendante de l’ubiquitination de Tax. Les facteurs Tax, p62 et IKKγ forment des complexes localisés au niveau de membranes autophagiques. Le facteur p62 promeut spécifiquement l’activation de la voie NF-κB médiée par Tax. Étonnamment, la sur-expression de p62 limite la capacité de Tax à activer la voie NF-κB, en induisant la déplétion cytosolique de Tax. Ces résultats indiquent que p62 peut exercer des effets antagonistes sur Tax selon son taux d’expression. Des données préliminaires suggèrent que Tax lie également d’autres membres de la famille des SLR, avec des conséquences variables sur l’activation de la voie NF-κB.Ce travail apporte des connaissances nouvelles concernant les relations entre Tax, la signalisation NF-κB et la machinerie autophagique, suggérant l’utilisation des membranes autophagiques comme plateformes de signalisation virale. / NF-κB constitutive activation is a key step in the HTLV-1-mediated T lymphocytes transformation process. This activation is mainly driven by the viral protein Tax, which recruits the IKKγ regulator factor. Previous work performed in our lab showed that Tax-induced NF-κB activation is promoted by the interaction with several cellular factors such as Optineurin (OPTN) and Tax1-binding protein 1 (TAX1BP1), two members of the Sequestosome-Like Receptors (SLR) family, rising the hypothesis of functional interplay vetween NFκB signaling and the autophagic pathway.Our study demonstrates that Tax interacts with the p62 receptor, which is another SLR member, in a direct, ubiquitin independent manner. Tax and p62 form complexes located at autophagic membranes, together with IKKγ. P62 potentiates the Tax-mediated NF-κB activation. Unexpectedly, p62 over-expression inhibits Tax-mediated NF-κB activation by inducing Tax cytoplasmic depletion. These results show that p62 plays a dual role on Tax in a dose-dependent manner. Preliminary data suggest that Tax is also able to interact with other SLR, with various consequences on activation of the NF-κB pathway.This work contributes to the further caracterization of the complex interplay between Tax, NF-κB signaling and the autophagic pathway, suggesting the use of autophagic membranes as viral signaling platforms.

Les facteurs de transcription STAT3 sont activés dans de nombreuses tumeurs et leurs effets sur la prolifération et la survie suggéraient fortement que ces protéines puissent être impliquées à la fois dans la transformation cellulaire et dans l'échappement aux traitements classiques de chimiothérapie.<br />Nous nous sommes donc intéressés aux différents aspects impliquant STAT3 dans la réponse de lignées cellulaires aux agents génotoxiques de chimiothérapie, et plus particulièrement aux inhibiteurs de topoisomérase. Durant ces traitements, STAT3 interagit avec le répresseur transcriptionnel Rb et l'inhibiteur du cycle cellulaire p21. Ces deux protéines inhibent son activité transcriptionnelle, notamment sur les gènes c-myc et cdc25A, et permettent la mise en place de la sénescence induite par les dommages de l'ADN et la catastrophe mitotique. Cependant, en présence d'une activité constitutive de STAT3 induite par l'oncogène v-src, STAT3 empêche l'activation de Rb et de p21, favorise la résistance des cellules aux inhibiteurs de topoisomérase II, et génère de l'instabilité génomique. Finalement,<br />deux inhibiteurs de STAT3, le cetuximab, un anticorps monoclonal dirigé contre l'EGFR, et un inhibiteur de la tyrosine kinase c-src, sensibilisent des cellules colorectales aux inhibiteurs de topoisomérase I. L'inhibition de STAT3 empêche l'activation du gène Eme1 qui induit l'expression d'une protéine de réparation de l'ADN.<br />STAT3 est donc un facteur de résistance aux inhibiteurs de topoisomérase. Sa détection pourrait ainsi permettre de mieux prédire la réponse des patients à ces inhibiteurs, et son inhibition, dans les tumeurs où il est actif, pourrait permettre de les sensibiliser aux inhibiteurs de topoisomérase.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) est responsable d’environ 25% de l’ensemble des cancers pédiatriques. Chez 85% des enfants diagnostiqués, la LLA entraîne une prolifération massive et incontrôlée de lymphocytes immatures de type précurseurs B dans la moelle osseuse (LLA pré-B). Des avancées intéressantes ont été faites au cours des trente dernières années et ont mené à une augmentation de l’efficacité des traitements thérapeutiques. Plus de 80% des enfants atteints de LLA seront guéris de cette maladie. Malheureusement, ces traitements manquent de spécificité à cause du manque de connaissances sur les mécanismes moléculaires impliqués durant l’initiation et le développement de la LLA pré-B pédiatrique. En d’autres termes, nous connaissons peu de chose sur l’étiologie de cette maladie. Plus de 25% des enfants atteints de la LLA pré-B présentent la translocation chromosomique t(12;21)(p13;q22) qui implique les gènes ETV6 et AML1. Celle-ci est formée in utero et mène à l’expression de la protéine chimère transcriptionnelle ETV6-AML1, dont la présence seule ne suffit pas au développement de la LLA pré-B. Ainsi, d’autres événements génétiques sont nécessaires au développement de cette leucémie. La délétion de l’allèle résiduel de ETV6 est un événement génétique fréquemment rencontré au moment du diagnostic de la LLA pré-B t(12;21)+. Cette délétion entraîne l’inactivation complète de ETV6 dans les lymphocytes pré-B leucémiques. ETV6 est un répresseur transcriptionnel de la famille Ets. Mon hypothèse de recherche est que ETV6 agit comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. L’inactivation de ETV6 causerait une dérégulation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles et, par le fait même, favoriserait l’initiation et le déroulement de la leucémogenèse pédiatrique. Dans le cadre de mon projet, comme peu de cibles transcriptionnelles de ETV6 sont connues, j’ai effectué des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine et des essais luciférases qui ont permis d’identifier six nouvelles cibles transcriptionnelles: TP53 (p53 et Δ133p53), SPHK1, IL-18, PTGER4 et LUM. J’ai démontré que la régulation transcriptionnelle médiée par ETV6 requiert la présence de ses deux domaines fonctionnels: PNT (interactions protéiques) et ETS (liaison à l’ADN). Ces domaines favorisent la reconnaissance d’un site EBS consensus dans une région située près du promoteur de base. Ce mécanisme peut dépendre du promoteur régulé par ETV6, mais également du contexte cellulaire. Des études fonctionnelles réalisées sur des lymphocytes pré-B leucémiques ont permis de mesurer l’impact de la dérégulation de l’expression des cibles transcriptionnelles de ETV6 sur trois voies biologiques: la prolifération cellulaire, l’apoptose induite par un stress génotoxique et la migration cellulaire dirigée par la voie de signalisation CXCL12/CXCR4. Ceci a permis de démontrer l’implication des gènes SPHK1, IL-18 et PTGER4 durant la leucémogenèse pédiatrique. Cette étude est une des premières à suggérer le rôle de ETV6 comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. Suite à l’inactivation du répresseur transcriptionnel ETV6, l’augmentation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles favoriserait la prolifération et la survie des lymphocytes pré-B leucémiques dans la moelle osseuse. L’identification de nouveaux gènes impliqués dans le développement de la LLA pré-B pédiatrique ouvre la porte au développement de nouveaux traitements thérapeutiques qui pourront présenter une meilleure spécificité envers l’étiologie de la maladie. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) accounts for approximately 25% of all paediatric cancers. Approximately 85% of ALL cases happen in immature B precursors lymphocytes (pre-B ALL). Pre-B ALL is a sporadic cancer that leads to the massive proliferation of leukemia pre-B lymphocytes in the bone marrow. During the past 30 years, the scientific community has developed efficient therapeutic treatments against paediatric ALL, reaching more than 80% cure rate. However, these treatments lack specificity because of the lack of knowledge regarding the molecular mechanisms involved in the initiation and progression of paediatric pre-B ALL. In other words, we know little about the aetiology of this disease. Approximately 25% of children affected with pre-B ALL carry the chromosomal translocation t(12;21)(p13;q22) involving the ETV6 and AML1 genes. This translocation originates in utero and leads to the expression of the transcriptional chimera ETV6-AML1, which alone is insufficient to trigger the development of pre-B ALL. Therefore, other genetic events would be required to initiate paediatric leukemogenesis. The deletion of the residual allele of ETV6 is frequently observed at the diagnosis of pre-B ALL t(12;21)+. This leads to the complete inactivation of ETV6 in leukemia pre-B lymphocytes. ETV6 is a transcriptional repressor of the Ets family. My research hypothesis is that ETV6 acts as a tumour suppressor gene in paediatric pre-B ALL. The inactivation of ETV6 would lead to the deregulated expression of its transcriptional targets and, consequently, would favour the initiation and progression of paediatric leukemogenesis. Given the fact that only very few ETV6 transcriptional targets are known, I initially performed chromatin immunoprecipitation experiments and luciferase assays that enabled the identification of six novel transcriptional targets: TP53 (p53 and Δ133p53), SPHK1, IL-18, PTGER4 and LUM. The ETV6-mediated transcriptional regulation involves both functional domains: PNT (protein interactions) and ETS (DNA-binding domain). These functional domains facilitate the recognition of consensus EBS sites located in a region close to the basal promoter, a molecular mechanism used according to the target promoter and cellular context. Functional studies using leukemia pre-B lymphocytes were useful to understand the role of the ETV6 transcriptional targets during cell proliferation, induction of apoptosis and cell migration through the CXC12/CXCR4 signalling pathway. These functional studies showed the implication of SPHK1, IL-18 and PTGER4 genes during paediatric leukemogenesis. This study is one of the first to support the role of ETV6 as a tumour suppressor gene in paediatric pre-B ALL. Once ETV6 is inactivated, the increased expression of its transcriptional targets favours the proliferation and survival of leukemia pre-B lymphocytes in the bone marrow. The identification of new genes involved in the development of paediatric pre-B ALL opens new doors to the development of therapeutic treatments with a better specificity toward the aetiology of the disease.

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