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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido à notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o diagnóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quando cepas de referência foram analisadas. A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validada empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espécies. A PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexas, dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, A PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria. / Leishmaniasis is zoonosis caused by parasite protozoa belonging to the genus Leishmania, which comprises about 30 species, and of these about 20 are responsible for causing human diseases. Leishmaniasis is characterized by considerable clinical pleomorphism and epidemiological variability. Diagnosis of Leishmania infection associated with the identification of the causative species is important for prognosis, definition of appropriate treatment schemes and epidemiological surveillance of the disease. In this context, PCR-based methods have been the most investigated and therefore many methods have been described, although there are still limitations in terms of validation and ability to discriminate between different Leishmania species. In Brazil there are at least seven species associated with human cutaneous Leishmaniasis (CL) and one species associated with visceral Leishmaniasis. The main goal of this study was to establish a methodology presenting both good sensitivity and capacity to identify the causative etiologic agent of the infection at species level. To this end, this study employed different methodologies based on PCR already used in several studies focusing on the molecular diagnosis of Leishmaniasis: kDNA PCR, ITS1 PCR and g6p PCR. The limit of detection, sensitivity in the face of clinical samples obtained from patients diagnosed with CL and the ability of these methodologies to discriminate between species related to human CL in Brazil were evaluated. Furthermore, considering previous results from our group showing that regions of the hsp70 gene could be used to achieve this goal, we developed PCR-based methodologies targeting fragments that correspond to different hsp70 gene regions, with sizes ranging from the 230pb to 390pb. Considering the four regions that were analyzed, we chose one (here named as hsp70C PCR) for having presenting the best detection limit of Leishmania DNA and the capacity of discriminating human pathogens Leishmania species that circulate in Brazil, when reference strains were analyzed by PCR RFLP hsp70C. The sensitivity of hsp70C PCR using DNA extracted from tissue collected from patients diagnosed with CL compared with the other methods mentioned above. In addition, the ability of hsp70C PCR-RFLP to identify Leishmania species has been validated using a panel of 70 Leishmania strains, representing different species and geographic regions aditionaly clinical material was also analyzed. The results suggest that kDNA PCR is a very sensitive method and therefore suitable for the molecular diagnosis of Leishmaniasis, but does not allow the identification of the species envolved in the infection. The ITS1 PCR is quite sensitive for the diagnosis of Leishmaniasis, but the non ability to identify the sympatric species like L.guyanensis and L.braziliensis, by PCR-RFLP limits its use in some in the South America. Finally, PCR-RFLP hsp70C, combines good sensitivity to detect Leishmania DNA extracted from clinical material and the ability to identify all Leishmania species that circulate in Brazil, being particularly useful in areas where Leishmania species are simpatric.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6962 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Graça, Grazielle Cardoso da |
| Contributors | Britto, Constança Felícia De Paoli de Carvalho, Cruz, Alda Maria da, Madeira, Maria de Fátima, Suárez-Mutis, Martha Cecilia, Cupolillo, Elisa |
| Publisher | Instituto Oswaldo Cruz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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