Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T13:25:42Z No. of bitstreams: 1 Grazielle Cardoso da Graça.pdf: 2006498 bytes, checksum: 53326885a5878760b37f852744da05fd (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T13:25:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grazielle Cardoso da Graça.pdf: 2006498 bytes, checksum: 53326885a5878760b37f852744da05fd (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido à notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o diagnóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quando cepas de referência foram analisadas. A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validada empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espécies. A PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexas, dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, A PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria. / Leishmaniasis is zoonosis caused by parasite protozoa belonging to the genus Leishmania, which comprises about 30 species, and of these about 20 are responsible for causing human diseases. Leishmaniasis is characterized by considerable clinical pleomorphism and epidemiological variability. Diagnosis of Leishmania infection associated with the identification of the causative species is important for prognosis, definition of appropriate treatment schemes and epidemiological surveillance of the disease. In this context, PCR-based methods have been the most investigated and therefore many methods have been described, although there are still limitations in terms of validation and ability to discriminate between different Leishmania species. In Brazil there are at least seven species associated with human cutaneous Leishmaniasis (CL) and one species associated with visceral Leishmaniasis. The main goal of this study was to establish a methodology presenting both good sensitivity and capacity to identify the causative etiologic agent of the infection at species level. To this end, this study employed different methodologies based on PCR already used in several studies focusing on the molecular diagnosis of Leishmaniasis: kDNA PCR, ITS1 PCR and g6p PCR. The limit of detection, sensitivity in the face of clinical samples obtained from patients diagnosed with CL and the ability of these methodologies to discriminate between species related to human CL in Brazil were evaluated. Furthermore, considering previous results from our group showing that regions of the hsp70 gene could be used to achieve this goal, we developed PCR-based methodologies targeting fragments that correspond to different hsp70 gene regions, with sizes ranging from the 230pb to 390pb. Considering the four regions that were analyzed, we chose one (here named as hsp70C PCR) for having presenting the best detection limit of Leishmania DNA and the capacity of discriminating human pathogens Leishmania species that circulate in Brazil, when reference strains were analyzed by PCR RFLP hsp70C. The sensitivity of hsp70C PCR using DNA extracted from tissue collected from patients diagnosed with CL compared with the other methods mentioned above. In addition, the ability of hsp70C PCR-RFLP to identify Leishmania species has been validated using a panel of 70 Leishmania strains, representing different species and geographic regions aditionaly clinical material was also analyzed. The results suggest that kDNA PCR is a very sensitive method and therefore suitable for the molecular diagnosis of Leishmaniasis, but does not allow the identification of the species envolved in the infection. The ITS1 PCR is quite sensitive for the diagnosis of Leishmaniasis, but the non ability to identify the sympatric species like L.guyanensis and L.braziliensis, by PCR-RFLP limits its use in some in the South America. Finally, PCR-RFLP hsp70C, combines good sensitivity to detect Leishmania DNA extracted from clinical material and the ability to identify all Leishmania species that circulate in Brazil, being particularly useful in areas where Leishmania species are simpatric.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-18T20:17:52Z No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-18T20:17:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é endêmica na América Latina, afetando mais de 15 milhões de pessoas. Como seu tratamento apresenta eficácia limitada e considerável toxicidade novas drogas são necessárias. Neste contexto, com a colaboração de grupos de química medicinal, nosso objetivo é a investigação da atividade tripanocida, seletividade, alvos celulares e mecanismos de ação de diamidinas aromáticas (DAs) e análogos. Inicialmente avaliamos o efeito tripanocida de onze DAs sobre as formas tripomastigotas e amastigotas intracelulares, assim como sua toxicidade para células de mamíferos e localização intracelular no parasito. Entre estes onze compostos, 2, 5 e 7 foram os mais ativos, com valores de IC50 na faixa micromolar e um alto índice de seletividade sobre as duas formas de T. cruzi. Através de microscopia de fluorescência (MF) foi possível localizar todos os compostos em organelas ricas em DNA, núcleo e mitocôndria (kDNA) e a análise ultraestrutural utilizando os compostos 5 e 7 revelou que estes compostos levam a danos mitocondriais, incluindo desorganização do kDNA em formas tripomastigotas. O acúmulo das diamidinas foi maior no kDNA do que no núcleo, porém tal acúmulo não está correlacionado a uma maior atividade tripanocida. A seguir, visando um melhor entendimento do mecanismo de ação de diamidinas e análogos, investigamos uma possível correlação entre as propriedades de ligação ao kDNA de treze compostos com a atividade tripanocida, através de estudos de desnaturação térmica (Tm) e dicroísmo circular (DiC). Nossos resultados mostram tanto com kDNA purificado de epimastigotas como com uma sequência conservada de 22-mer presente em minicírculos de T. cruzi, que a forte interação de amidinas ao kDNA não é o fator determinante para desencadear sua atividade tripanocida. Nosso próximo passo foi a avaliação de alterações topológicas induzidas por dez compostos aromáticos sobre o kDNA de T. cruzi através de alteração da mobilidade em gel e MF. Os estudos eletroforéticos foram conduzidos pela incubação de fragmentos de kDNA, obtidos pela digestão com as endonucleases EcoRI e CvQI, com os compostos por análise em gel de poliacrilamida. As diamidinas DB889 e DB185 induziram consideráveis alterações na mobilidade dos fragmentos. Além disso, incubando a rede intacta e purificada de kDNA com a DB75 e monitorando o efeito por MF, obervarmos a capacidade desta DA de induzir um grande aumento da área da rede. Em resumo, nossos resultados revelam que diamidinas e congêneres são capazes de induzir profundas alterações na topologia do kDNA do T. cruzi sugerindo que esta estrutura pode ser um dos possíveis alvos destes compostos. Entretanto, a localização preferencial dos compostos no kDNA, assim como sua afinidade à esta estrutura e capacidade de alterar a mobilidade dos fragmentos em géis de poliacrilamida não está correlacionada com sua atividade tripanocida. Estes dados sugerem fortemente que outros fatores podem estar envolvidos no mecanismo de ação destes compostos, operando de modo primário ou secundário a interação composto:kDNA. Outros estudos serão necessários para melhor identificar os mecanismos envolvidos na ação destes compostos, visando contribuir para o desenho racional de compostos líderes para o tratamento da doença de Chagas. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, is endemic in Latin America, affecting more de 15 million people. Due to the limited efficacy and considerable toxicity, the therapy for Chagas disease is far from being considerable ideal and thus alternative drugs are urgently needed. In this context, with the collaborations of medicinal chemistry groups, our aim was to investigate the trypanocidal activity, selectivity, cellular targets and mechanisms of action of aromatic diamidines (ADs) and analogues. First, we tested the trypanocidal effect of eleven ADs upon intracellular amastigotes and trypomastigotes, their toxicity towards mammalian cells and their sub-cellular localization. Compounds 2, 5 and 7 were the most active, presenting IC50 values on the micromolar range and displaying high selectivity indexes for both T. cruzi forms. Using fluorescence microscopy (FM), all the compounds were localized in organelles rich in DNA, nucleus and mitochondrion (kDNA) and in bloodstream forms treated with the compounds 5 and 7 we observed ultrastructural damages on mitochondrial organelle, including kDNA disorganization. The accumulation of the diamidines was higher in the kDNA than in the nucleus, but such accumulation could not be correlated with a higher trypanocidal activity. Next, aiming to better understand the mechanism of action of diamidines and analogues, we investigated the possible correlation between kDNA binding properties of thirteen compounds with their anti-T. cruzi effect, through thermal denaturation (T m) and circular dichroism (CiD) studies. Our data demonstrated using the purified kDNA of epimastigotes or a conserved synthetic parasite sequence of 22-mer present in T. cruzi minicircles, that the strong interaction of the amidines with the kDNA is not a determinant factor to the triggering of the trypanocidal activity. Our next step was the evaluation of topological changes induced by ten aromatic compounds on T. cruzi kDNA, through gel mobility shifts and FM. The eletrophoretic studies were conducted by the incubation of kDNA fragments obtained by digestion with the endonucleases EcoRI e CvQI with the compounds and analysis by poliacrylamide gel. The diamidines DB889 and DB185 induced substantial mobility shifts in the fragmented bands. Additionally, by FM of whole kDNA network incubated with DB75 we observed the ability of this diamidine to cause a striking expansion of the kDNA network area. Taken together our results suggest that diamidines and related compounds provoke profound alterations in the normal topology of T. cruzi kDNA suggesting that this structure may represent one of the potential targets of these compounds. However, the compound preferential accumulation in kDNA, as well as their affinity and capability of inducing topological changes in that structure is not correlated with their anti-T. cruzi activity. These findings strongly suggest that other molecular mechanisms may be also operating primarily or secondarily to the drug:KDNA interaction. Further studies are needed to better identify the mechanisms involved in the activity of this class of chemical, aiming to contribute to the rational design of lead compounds for the treatment of Chagas disease .

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:15:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Perez_ArinaMarina_D.pdf: 16850057 bytes, checksum: c8339559e1407d1727e423826290d6c8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: LaRbp38 e uma proteína exclusiva de protozoários tripanosomatideos, entre os quais está os agentes etiológicos da leishmaniose, uma doença endêmica presente em diversas regiões do Brasil. LaRbp38 e codificada por um gene nuclear, que parece exercer diferentes funções nas maquinarias de replicação nuclear e mitocondrial. Foi primeiramente descrita como proteína estabilizadora de RNA mitocondrial e parece estar envolvida com a replicação de DNA mitocondrial. Em Leishmania, LaRbp38 também interage in vivo com DNA mitocondrial, com sequencias ricas em GT e com DNA telomerico simples e dupla fita. Nesta tese mostramos estudos que nos levaram a caracterizar novas propriedades estruturais e biológicas desta proteína. Na primeira parte da tese mostramos, que a LaRbp38 inteira e mutantes truncados da proteína são capazes de interagir com diferentes tipos de DNAs: DNA simples e dupla fitas telomericos e kDNA, porem com diferentes afinidades. Desta forma, foi possível mapear a vizinhança de um domínio de interação desta proteína aos diferentes tipos de DNA (DBD). Como este domínio não compartilha similaridade estrutural com nenhum domínio descrito em outras proteínas, isto sugere que este pode ser um novo domínio presente exclusivamente em tripanosomatideos. Estes resultados estão compilados no artigo entitulado: "Mapping the boundaries of the DNA-binding domain of Leishmania amzonensis Rbp38 (LaRbp38)". Na segunda parte da tese, mostramos a localização subcelular da proteína e como ela e capaz de translocar por diferentes compartimentos celulares utilizando um sinal de localização mitocondrial presente no N-terminal e um sinal de localização nuclear, presente no Cterminal da proteína. Embora a proteína esteja presente de forma mais abundante no cinetoplasto, e possível visualizá-la no núcleo quando o ciclo celular do parasita e sincronizado ou quando este e submetido a um estresse genotoxico. Baseado nesses achados também foram realizados ensaios de interação proteina-proteina, onde foi possível determinar a interação entre LaRbp38 e a proteína importina ?, uma proteína que esta diretamente ligada ao transporte de proteínas ao núcleo via NLS. Estes resultados também foram compilados em um artigo, que esta em fase de preparação, entitulado: "The protein LaRbp38 translocates between the nucleus and the kinetoplast in Leishmania (L.) amazonensis promastigotes". Outro estudo que realizamos para compreender a função da LaRbp38, o qual também esta na forma de um artigo: "LaRbp38 can form part of a shelterin-like complex in L.amazonensis telomeres", mostramos evidencias sobre a interação entre as proteínas LaRbp38 e a LaTRF de L.amazonensis. Aqui, uma analise in silico pela busca de motivos conservados em LaRbp38, nos levou a descobrir que esta proteína contem um motivo do tipo TRFH docking encontrado em proteínas telomericas que interagem com as proteínas da família das TRFs no complexo shelterina de vertebrados e mamíferos (ex: TIN2, PINX1 e APOLLO). Juntas, as TRFs e suas interatoras tem a função na manutenção dos telomeros. Sendo assim, utilizando ensaios de interação proteina-proteina, conseguimos mostrar que LaRbp38 interage fisicamente com a LaTRF, usando um motivo TRFH docking diferente daquele que foi primeiramente encontrado in silico. Nossos resultados mostram que a LaRbp38 interage com a LaTRF usando o motivo ALKTL, que compartilha similaridade de sequencia, com motivos descritos em proteínas interatoras de TRFs e bastante conservado entre as Rbp38 de tripanosomatideos. Estes resultados podem indicar que a LaRbp38 cumpre função análoga a uma das proteínas de vertebrados descritas como interatoras de TRFs, a proteína TIN2, que a exemplo de LaRbp38, também tem função nas mitocôndrias / Abstract: LaRbp38 is a trypanosomatid protein found exclusively in these protozoa, among which are the etiological agents of leishmaniasis, an endemic disease present in several regions of Brazil. LaRbp38 is a protein encoded by a nuclear gene, which probably plays different roles in both mitochondrial and nuclear replication machineries. It was first described as a mitochondrial RNA stabilizing protein involved in the replication of mitochondrial DNA. In Leishmania, LaRbp38 also interacts in vivo with mitochondrial DNA, GT-rich sequences and single- and double-stranded telomeric DNA. Here we show the results that led us to characterize some new biological and structural features of this protein. In the first part of the thesis we show that the entire LaRbp38 and its truncated mutants are able to interacts with different GT-rich DNAs and were possible to map the boundearies of a DNA-binding domain (DBD). This domain doesn't share any sequence or structural similarities with the domains described in other proteins suggesting that it could be a new domain present exclusively in trypanosomatids. These results are compiled in the article entitled: "Mapping the boundaries of the DNA-binding domain of Leishmania amzonensis Rbp38 (LaRbp38)." The second part of the thesis shows the subcellular localization of the protein and how it is able to translocate to different cellular compartments using an N-terminal mitochondrial localization signal (MLS) and a nuclear localization signal (NLS) present in the C-terminus of the protein. Although the protein is seem more abundantly in the mitochondria associated with kinetoplast DNA, its nuclear localization seems to be cell cycle dependent and enhanced at the end of S phase or when parasites are subjected to genotoxic stress. In order to confirm that the protein is able to translocate to the nucleus, we used different in silico approaches. The results strongly suggest the existence of a non-classical and also non-bipartite NLS at the C-terminus of LaRbp38. Based on these findings we did protein-protein interaction assays and verified that LaRbp38 can associate in vitro with importin ?, which is directly linked to protein transport to the nucleus via a NLS. These results were also compiled in an article, which is in preparation, entitled: The LaRbp38 protein translocates between the nucleus and the kinetoplast in Leishmania amazonensis promastigotes. Another study that was carried out and present in the third part of the thesis shows evidence about the interaction between LaRbp38 and the telomeric L.amazonensis LaTRF protein. These results are presented as an article entitled: "LaRbp38 can form part of a shelterina-like complex in L.amazonensis telomeres," Here, an in silico analysis search for conserved motifs in LaRbp38, showed that this protein contains a motif, the TRFH-docking-like typically found in proteins that associate with the TRF paralogue proteins (TRF1 and TRF2) in the shelterin complex of vertebrates and mammallian telomeres (eg.TIN2, PINX1 and APOLLO). TRFs and their interactors work together to regulate the dynamics of telomeric chromatin and telomere length maintenance. By using protein-protein interaction assays we show that LaRbp38 physically interacts with LaTRF. This interaction, however, seems to occurs via a new TRFH docking motif, which is different from the conserved core motif [FY]xLxP. This new TRFH-docking-like motif (ALKTL) aligns and share similarities with the TRH-docking motif described in the shelterin protein TIN2. This motif is also very conserved among the Rbp38 orthologues of other trypanosomatids. Curiously, TIN2 is a telomeric protein that shows nuclear and mitochondrial localization / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Introdução: O diagnóstico etiológico da leishmaniose tegumentar baseia-se na detecção do parasito em amostras de lesão colhida por método invasivo. A detecção de DNA do parasito, através da PCR, poderia ser uma alternativa mais sensível, porém não está disponível na rotina diagnóstica e foi padronizada em amostras clínicas colhidas por métodos invasivos, tais como raspado, aspirado ou biópsia da lesão. Uma proposta para o diagnóstico de leishmaniose tegumentar seria a obtenção de material de lesão (mucosa ou cutânea) através de métodos de coleta menos invasivos e que fosse possível detectar DNA do parasito a partir de pequenas quantidades de amostra clínica. Neste trabalho avaliamos a eficácia da PCR, em amostras colhidas por método não invasivo (swab de lesão) como ferramenta para ser utilizada no diagnóstico de leishmaniose (mucosa e cutânea localizada), bem como para detecção precoce de Leishmania em mucosa de pacientes com lesão cutânea ativa e como ferramenta de avaliação de resposta terapêutica na leishmaniose mucosa. Metodologia: Entre os meses de agosto de 2013 a julho de 2015 foram selecionados 57 pacientes no ambulatório de Leishmanioses do Instituto de Infectologia Emilio Ribas, dos quais foram coletadas amostras de lesão cutânea ou mucosa através de swab e de biópsia das lesões. Em paralelo, foi realizada rotina laboratorial para diagnóstico de leishmaniose nos pacientes que apresentavam lesão ativa (anatomopatológico, pesquisa e cultura de Leishmania, sorologia e teste de Montenegro). As amostras colhidas por biópsia ou swab foram avaliadas através da reação em cadeia da polimerase tendo como alvos o minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania para PCR convencional e o gene da proteína de choque térmico 70Kda (Hsp70) para PCR convencional e PCR em tempo real. Resultados: A detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab de lesões ativas foi semelhante as das amostras colhidas por biópsia das mesmas lesões. Quando comparado aos métodos comumente empregados no diagnóstico da leishmaniose tegumentar, a PCR em material colhido por swab apresentou desempenho superior. Foi demostrado que utilizando os iniciadores para o alvo kDNA obtivemos maior eficácia quando comparado com o alvo Hsp70, seja pela PCR convencional como pela PCR em tempo real (sensibilidade de 94.1%, 42.4% e 39.4%, respectivamente). Ao analisarmos amostras de pacientes já tratados para leishmaniose mucosa observamos positividade de 86% para kDNA e de 22% para Hsp70. Nas amostras de mucosa nasal íntegra e com leishmaniose cutânea ativa, coletadas com swab para detecção precoce da doença, obteve-se 92.9% de positividade com kDNA e 28.6% com Hsp70. Conclusões: Os resultados obtidos sugerem que o método de coleta de amostra biológica através do swab para o diagnóstico molecular da leishmaniose tegumentar apresenta eficácia comparada com o método de coleta por biópsia. A detecção de DNA em amostras colhidas por swab permite analisar a presença de DNA do parasito em tecido sem lesão, podendo detectar a presença de Leishmania mesmo antes de alterações clínicas estarem presentes. A monitorização da resposta terapêutica da leishmaniose mucosa pode ser feita através da detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab / Introduction: Etiologic diagnosis of tegumentary leishmaniasis is based on the detection of the parasite in injury samples collected by invasive method. DNA detection of the parasite by PCR, could be a more sensible alternative, but is not available in routine practice and it was standardized in clinical samples by invasive methods such as scrapes, aspirate or biopsy of the lesion. A proposal for the diagnosis of tegumentary leishmaniasis lesions would obtaining material (cutaneous or mucosal) through less invasive collection methods, and it was possible to detect parasite DNA from small quantities of clinical specimen. In this study we evaluate the effectiveness of the PCR in samples collected by non-invasive method (swab injury) as a tool to be used in the diagnosis of leishmaniasis (mucosal and localized cutaneous), as well as for early detection of Leishmania in mucosa from patients with cutaneous lesions active and as an evaluation tool of therapeutic response in mucosal leishmaniasis. Methodology: Between August 2013 to July 2015 were selected 57 patients from the Leishmaniasis out clinic from the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, which samples of cutaneous lesion or mucosa were collected by swab and biopsy of the lesions. In parallel, routine laboratory was carried out for the diagnosis of leishmaniasis in patients with active lesions (histopathology, search and Leishmania culture, serology and Montenegro skin test antigen). The samples taken by biopsy or swab were assessed by polymerase chain reaction having as targets the minicircle kinetoplast DNA (kDNA) of Leishmania for conventional PCR and gene heat shock protein 70kDa (Hsp70) for conventional PCR and real-time PCR. Results: Leishmania DNA detection in samples taken by swab of active lesions was similar to the samples taken by biopsy from the same lesion. When compared to the methods commonly used in the diagnosis of tegumentary leishmaniasis, PCR material collected by swab showed superior performance. It was shown that using the primers for the target kDNA obtained more effectively compared with the target Hsp70, or by conventional PCR and by real-time PCR (sensitivity 94.1%, 42.4% and 39.4%, respectively). When analyzing samples from patients already treated for mucosal leishmaniasis observed positivity of 86% to kDNA and 22% for Hsp70. Samples of nasal mucosa and active cutaneous leishmaniasis, collected by swab for early detection of disease, it obtained 92.9% positivity with kDNA and 28.6% with Hsp70. Conclusions: Our results suggest that the biological sample collection method using the swab for the molecular diagnosis of tegumentary leishmaniasis had compared efficacy with biopsy collection method. The DNA detection collected by swab samples allows to analyze the presence of DNA of the parasite in tissue without damage and can detect the presence of Leishmania even before clinical changes are present. The monitoring of therapeutic response mucosal leishmaniasis can be made by Leishmania DNA detection in samples per swab

Introdução: O diagnóstico etiológico da leishmaniose tegumentar baseia-se na detecção do parasito em amostras de lesão colhida por método invasivo. A detecção de DNA do parasito, através da PCR, poderia ser uma alternativa mais sensível, porém não está disponível na rotina diagnóstica e foi padronizada em amostras clínicas colhidas por métodos invasivos, tais como raspado, aspirado ou biópsia da lesão. Uma proposta para o diagnóstico de leishmaniose tegumentar seria a obtenção de material de lesão (mucosa ou cutânea) através de métodos de coleta menos invasivos e que fosse possível detectar DNA do parasito a partir de pequenas quantidades de amostra clínica. Neste trabalho avaliamos a eficácia da PCR, em amostras colhidas por método não invasivo (swab de lesão) como ferramenta para ser utilizada no diagnóstico de leishmaniose (mucosa e cutânea localizada), bem como para detecção precoce de Leishmania em mucosa de pacientes com lesão cutânea ativa e como ferramenta de avaliação de resposta terapêutica na leishmaniose mucosa. Metodologia: Entre os meses de agosto de 2013 a julho de 2015 foram selecionados 57 pacientes no ambulatório de Leishmanioses do Instituto de Infectologia Emilio Ribas, dos quais foram coletadas amostras de lesão cutânea ou mucosa através de swab e de biópsia das lesões. Em paralelo, foi realizada rotina laboratorial para diagnóstico de leishmaniose nos pacientes que apresentavam lesão ativa (anatomopatológico, pesquisa e cultura de Leishmania, sorologia e teste de Montenegro). As amostras colhidas por biópsia ou swab foram avaliadas através da reação em cadeia da polimerase tendo como alvos o minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania para PCR convencional e o gene da proteína de choque térmico 70Kda (Hsp70) para PCR convencional e PCR em tempo real. Resultados: A detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab de lesões ativas foi semelhante as das amostras colhidas por biópsia das mesmas lesões. Quando comparado aos métodos comumente empregados no diagnóstico da leishmaniose tegumentar, a PCR em material colhido por swab apresentou desempenho superior. Foi demostrado que utilizando os iniciadores para o alvo kDNA obtivemos maior eficácia quando comparado com o alvo Hsp70, seja pela PCR convencional como pela PCR em tempo real (sensibilidade de 94.1%, 42.4% e 39.4%, respectivamente). Ao analisarmos amostras de pacientes já tratados para leishmaniose mucosa observamos positividade de 86% para kDNA e de 22% para Hsp70. Nas amostras de mucosa nasal íntegra e com leishmaniose cutânea ativa, coletadas com swab para detecção precoce da doença, obteve-se 92.9% de positividade com kDNA e 28.6% com Hsp70. Conclusões: Os resultados obtidos sugerem que o método de coleta de amostra biológica através do swab para o diagnóstico molecular da leishmaniose tegumentar apresenta eficácia comparada com o método de coleta por biópsia. A detecção de DNA em amostras colhidas por swab permite analisar a presença de DNA do parasito em tecido sem lesão, podendo detectar a presença de Leishmania mesmo antes de alterações clínicas estarem presentes. A monitorização da resposta terapêutica da leishmaniose mucosa pode ser feita através da detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab / Introduction: Etiologic diagnosis of tegumentary leishmaniasis is based on the detection of the parasite in injury samples collected by invasive method. DNA detection of the parasite by PCR, could be a more sensible alternative, but is not available in routine practice and it was standardized in clinical samples by invasive methods such as scrapes, aspirate or biopsy of the lesion. A proposal for the diagnosis of tegumentary leishmaniasis lesions would obtaining material (cutaneous or mucosal) through less invasive collection methods, and it was possible to detect parasite DNA from small quantities of clinical specimen. In this study we evaluate the effectiveness of the PCR in samples collected by non-invasive method (swab injury) as a tool to be used in the diagnosis of leishmaniasis (mucosal and localized cutaneous), as well as for early detection of Leishmania in mucosa from patients with cutaneous lesions active and as an evaluation tool of therapeutic response in mucosal leishmaniasis. Methodology: Between August 2013 to July 2015 were selected 57 patients from the Leishmaniasis out clinic from the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, which samples of cutaneous lesion or mucosa were collected by swab and biopsy of the lesions. In parallel, routine laboratory was carried out for the diagnosis of leishmaniasis in patients with active lesions (histopathology, search and Leishmania culture, serology and Montenegro skin test antigen). The samples taken by biopsy or swab were assessed by polymerase chain reaction having as targets the minicircle kinetoplast DNA (kDNA) of Leishmania for conventional PCR and gene heat shock protein 70kDa (Hsp70) for conventional PCR and real-time PCR. Results: Leishmania DNA detection in samples taken by swab of active lesions was similar to the samples taken by biopsy from the same lesion. When compared to the methods commonly used in the diagnosis of tegumentary leishmaniasis, PCR material collected by swab showed superior performance. It was shown that using the primers for the target kDNA obtained more effectively compared with the target Hsp70, or by conventional PCR and by real-time PCR (sensitivity 94.1%, 42.4% and 39.4%, respectively). When analyzing samples from patients already treated for mucosal leishmaniasis observed positivity of 86% to kDNA and 22% for Hsp70. Samples of nasal mucosa and active cutaneous leishmaniasis, collected by swab for early detection of disease, it obtained 92.9% positivity with kDNA and 28.6% with Hsp70. Conclusions: Our results suggest that the biological sample collection method using the swab for the molecular diagnosis of tegumentary leishmaniasis had compared efficacy with biopsy collection method. The DNA detection collected by swab samples allows to analyze the presence of DNA of the parasite in tissue without damage and can detect the presence of Leishmania even before clinical changes are present. The monitoring of therapeutic response mucosal leishmaniasis can be made by Leishmania DNA detection in samples per swab

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2015silva-rp.pdf: 5571134 bytes, checksum: 19723480d7429ee48a1698d7e2ad1a17 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia

As técnicas sorológicas são os testes de referência para o diagnóstico da doença de Chagas, porém, são pouco efetivas para avaliar a resposta ao tratamento, uma vez que a soronegativação pode levar muitos anos. As sorologias também são usadas para identificar episódios de reativação em pacientes com algum grau de imunodeficiência, por exemplo, os co-infectados pelo HIV. Já a hemocultura e o xenodiagnóstico possuem elevada especificidade e baixa sensibilidade, requerendo de 30 a 120 dias para a liberação do resultado final, podendo gerar resultados falso-negativos especialmente na fase crônica da infecção. Diante disso, a PCR em tempo real (qPCR), técnica com elevada sensibilidade e especificidade, poderia ser utilizada para detectar e quantificar a carga parasitária, permitindo o diagnóstico de episódios de reativação e o monitoramento de pacientes em tratamento. A escolha dos alvos de amplificação e dos iniciadores da qPCR é desafiadora, já que ainda não existe consenso na literatura sobre a melhor sequência alvo de amplificação e os melhores iniciadores. No presente estudo, foram selecionados iniciadores do DNA nuclear (F2/B3) e do mitocondrial (32F/148R) de T. cruzi. Posteriormente, para validação dos ensaios, foram obtidas amostras de sangue, cérebro, coração, pulmão, fígado, baço, rim, intestino, glândulas adrenais, tecido adiposo e tecido muscular esquelético de 24 camundongos Swiss adultos, infectados intraperitonealmente com 103 formas tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi. Amostras foram colhidas no 13º, 26º e 61º dias pós-infecção, correspondendo a diferentes intensidades de carga parasitária (alta, média e baixa). As amostras foram analisadas por qPCR com SYBR Green. Os resultados mostraram que os iniciadores do DNA nuclear e mitocondrial detectaram T. cruzi de forma específica, sendo que as maiores cargas parasitárias foram detectadas pelos iniciadores do DNA nuclear, embora os iniciadores do DNA mitocondrial tenham apresentado maior sensibilidade analítica (0,002 e 0,0002 de um único parasito, respectivamente). As duas qPCR obtiveram índices adequados de reprodutibilidade e repetibilidade inferiores a 25%. Os parâmetros de eficiência, (90%- 110%) e linearidade (R2 >= 0.98) das duas qPCR apresentaram valores adequados de acordo com o estabelecido pela literatura especializada. A comparação do threshold cycle (CT) das duas qPCR não apresentou diferença estatística. Em relação à carga parasitária foi possível detectar o DNA do parasito em todas as amostras de sangue e tecidos, com distribuição universal, porém heterogênea, e em todas as fases da infecção. O modelo animal utilizado neste estudo foi adequado para validar as duas qPCR voltadas à detecção e quantificação da carga parasitária. De acordo com os parâmetros estabelecidos, as duas qPCR, com iniciadores do DNA nuclear e do mitocondrial, foram padronizadas e validadas com sucesso, sendo capazes de quantificar todos os tipos de amostras (sangue e órgãos), nas fases aguda, subaguda e crônica da doença, sinalizando positivamente para a utilização dos dois ensaios moleculares no diagnóstico da infecção por T. cruzi. / Serological techniques are the gold standards for the diagnosis of Chagas\' disease, but are not very effective in evaluating the response to treatment, since seronegativation may take many years. Serology is also used to identify reactivation episodes in patients with some degree of immunodeficiency, for example those co-infected with HIV. Hemoculture and xenodiagnosis have high specificity and low sensitivity, requiring 30 to 120 days for releasing a final result, and they can generate false-negative results especially in the chronic phase of infection. Therefore, real-time PCR (qPCR), a technique with high sensitivity and specificity, could be used to detect and quantify the parasite load, allowing the diagnosis of reactivation episodes and the monitoring of patients undergoing treatment. The choice of amplification targets and qPCR primers is challenging since there is as yet no consensus in the literature about the best amplification target sequence and the best primers. In the present study, primers from the nuclear (F2/B3) and mitochondrial, kDNA (32F/148R) T. cruzi sequences were designed. Samples were obtained from the blood, brain, heart, lung, liver, spleen, kidney, intestine, adrenal glands, adipose tissue and skeletal muscle tissue of 24 adult Swiss mice, infected intraperitoneally with 103 trypomastigote forms of the Y strain of Trypanosoma cruzi. The samples were collected at the 13th, 26th and 61st post-infection days, corresponding to different parasite load levels (low, medium and high), and were analyzed by qPCR with SYBR Green. The results showed that the nuclear and mitochondrial DNA primers detected T. cruzi DNA in a specific way. The nuclear primers detected higher parasite load levels than the kDNA ones, although the kDNA primers presented higher analytical sensitivity (0.002 and 0.0002 of a single parasite, respectively). The two qPCRs showed adequate reproducibility and repeatability indexes, i.e., below 25%. The efficiency parameters, (90% - 110%) and linearity (R2 >=0.98) of the two qPCRs showed adequate values according to the established literature. The comparison of the threshold cycle (CT) of the two qPCRs found no statistical difference. Regarding the parasite load, it was possible to detect the parasite DNA in all blood and tissue samples, with universal distribution, however heterogeneous, and at all stages of infection. The animal model used in this study was adequate to validate the two qPCRs for the detection and quantification of the parasite load. According to established parameters, the two qPCRs, with nuclear and mitochondrial primers, were successfully standardized and validated, being able to quantify all types of samples (blood and organs), in the acute, subacute and chronic phases of the disease, signaling positively to the use of both molecular assays in the diagnosis of T. cruzi infections.

As técnicas sorológicas são os testes de referência para o diagnóstico da doença de Chagas, porém, são pouco efetivas para avaliar a resposta ao tratamento, uma vez que a soronegativação pode levar muitos anos. As sorologias também são usadas para identificar episódios de reativação em pacientes com algum grau de imunodeficiência, por exemplo, os co-infectados pelo HIV. Já a hemocultura e o xenodiagnóstico possuem elevada especificidade e baixa sensibilidade, requerendo de 30 a 120 dias para a liberação do resultado final, podendo gerar resultados falso-negativos especialmente na fase crônica da infecção. Diante disso, a PCR em tempo real (qPCR), técnica com elevada sensibilidade e especificidade, poderia ser utilizada para detectar e quantificar a carga parasitária, permitindo o diagnóstico de episódios de reativação e o monitoramento de pacientes em tratamento. A escolha dos alvos de amplificação e dos iniciadores da qPCR é desafiadora, já que ainda não existe consenso na literatura sobre a melhor sequência alvo de amplificação e os melhores iniciadores. No presente estudo, foram selecionados iniciadores do DNA nuclear (F2/B3) e do mitocondrial (32F/148R) de T. cruzi. Posteriormente, para validação dos ensaios, foram obtidas amostras de sangue, cérebro, coração, pulmão, fígado, baço, rim, intestino, glândulas adrenais, tecido adiposo e tecido muscular esquelético de 24 camundongos Swiss adultos, infectados intraperitonealmente com 103 formas tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi. Amostras foram colhidas no 13º, 26º e 61º dias pós-infecção, correspondendo a diferentes intensidades de carga parasitária (alta, média e baixa). As amostras foram analisadas por qPCR com SYBR Green. Os resultados mostraram que os iniciadores do DNA nuclear e mitocondrial detectaram T. cruzi de forma específica, sendo que as maiores cargas parasitárias foram detectadas pelos iniciadores do DNA nuclear, embora os iniciadores do DNA mitocondrial tenham apresentado maior sensibilidade analítica (0,002 e 0,0002 de um único parasito, respectivamente). As duas qPCR obtiveram índices adequados de reprodutibilidade e repetibilidade inferiores a 25%. Os parâmetros de eficiência, (90%- 110%) e linearidade (R2 >= 0.98) das duas qPCR apresentaram valores adequados de acordo com o estabelecido pela literatura especializada. A comparação do threshold cycle (CT) das duas qPCR não apresentou diferença estatística. Em relação à carga parasitária foi possível detectar o DNA do parasito em todas as amostras de sangue e tecidos, com distribuição universal, porém heterogênea, e em todas as fases da infecção. O modelo animal utilizado neste estudo foi adequado para validar as duas qPCR voltadas à detecção e quantificação da carga parasitária. De acordo com os parâmetros estabelecidos, as duas qPCR, com iniciadores do DNA nuclear e do mitocondrial, foram padronizadas e validadas com sucesso, sendo capazes de quantificar todos os tipos de amostras (sangue e órgãos), nas fases aguda, subaguda e crônica da doença, sinalizando positivamente para a utilização dos dois ensaios moleculares no diagnóstico da infecção por T. cruzi. / Serological techniques are the gold standards for the diagnosis of Chagas\' disease, but are not very effective in evaluating the response to treatment, since seronegativation may take many years. Serology is also used to identify reactivation episodes in patients with some degree of immunodeficiency, for example those co-infected with HIV. Hemoculture and xenodiagnosis have high specificity and low sensitivity, requiring 30 to 120 days for releasing a final result, and they can generate false-negative results especially in the chronic phase of infection. Therefore, real-time PCR (qPCR), a technique with high sensitivity and specificity, could be used to detect and quantify the parasite load, allowing the diagnosis of reactivation episodes and the monitoring of patients undergoing treatment. The choice of amplification targets and qPCR primers is challenging since there is as yet no consensus in the literature about the best amplification target sequence and the best primers. In the present study, primers from the nuclear (F2/B3) and mitochondrial, kDNA (32F/148R) T. cruzi sequences were designed. Samples were obtained from the blood, brain, heart, lung, liver, spleen, kidney, intestine, adrenal glands, adipose tissue and skeletal muscle tissue of 24 adult Swiss mice, infected intraperitoneally with 103 trypomastigote forms of the Y strain of Trypanosoma cruzi. The samples were collected at the 13th, 26th and 61st post-infection days, corresponding to different parasite load levels (low, medium and high), and were analyzed by qPCR with SYBR Green. The results showed that the nuclear and mitochondrial DNA primers detected T. cruzi DNA in a specific way. The nuclear primers detected higher parasite load levels than the kDNA ones, although the kDNA primers presented higher analytical sensitivity (0.002 and 0.0002 of a single parasite, respectively). The two qPCRs showed adequate reproducibility and repeatability indexes, i.e., below 25%. The efficiency parameters, (90% - 110%) and linearity (R2 >=0.98) of the two qPCRs showed adequate values according to the established literature. The comparison of the threshold cycle (CT) of the two qPCRs found no statistical difference. Regarding the parasite load, it was possible to detect the parasite DNA in all blood and tissue samples, with universal distribution, however heterogeneous, and at all stages of infection. The animal model used in this study was adequate to validate the two qPCRs for the detection and quantification of the parasite load. According to established parameters, the two qPCRs, with nuclear and mitochondrial primers, were successfully standardized and validated, being able to quantify all types of samples (blood and organs), in the acute, subacute and chronic phases of the disease, signaling positively to the use of both molecular assays in the diagnosis of T. cruzi infections.