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Previous issue date: 2011 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é endêmica na América Latina, afetando mais
de 15 milhões de pessoas. Como seu tratamento apresenta eficácia limitada e considerável
toxicidade novas drogas são necessárias. Neste contexto, com a colaboração de grupos de química
medicinal, nosso objetivo é a investigação da atividade tripanocida, seletividade, alvos celulares e
mecanismos de ação de diamidinas aromáticas (DAs) e análogos. Inicialmente avaliamos o efeito
tripanocida de onze DAs sobre as formas tripomastigotas e amastigotas intracelulares, assim como
sua toxicidade para células de mamíferos e localização intracelular no parasito. Entre estes onze
compostos, 2, 5 e 7 foram os mais ativos, com valores de IC50 na faixa micromolar e um alto índice de
seletividade sobre as duas formas de T. cruzi. Através de microscopia de fluorescência (MF) foi
possível localizar todos os compostos em organelas ricas em DNA, núcleo e mitocôndria (kDNA) e a
análise ultraestrutural utilizando os compostos 5 e 7 revelou que estes compostos levam a danos
mitocondriais, incluindo desorganização do kDNA em formas tripomastigotas. O acúmulo das
diamidinas foi maior no kDNA do que no núcleo, porém tal acúmulo não está correlacionado a uma
maior atividade tripanocida. A seguir, visando um melhor entendimento do mecanismo de ação de
diamidinas e análogos, investigamos uma possível correlação entre as propriedades de ligação ao
kDNA de treze compostos com a atividade tripanocida, através de estudos de desnaturação térmica
(Tm) e dicroísmo circular (DiC). Nossos resultados mostram tanto com kDNA purificado de
epimastigotas como com uma sequência conservada de 22-mer presente em minicírculos de T. cruzi,
que a forte interação de amidinas ao kDNA não é o fator determinante para desencadear sua
atividade tripanocida. Nosso próximo passo foi a avaliação de alterações topológicas induzidas por
dez compostos aromáticos sobre o kDNA de T. cruzi através de alteração da mobilidade em gel e
MF. Os estudos eletroforéticos foram conduzidos pela incubação de fragmentos de kDNA, obtidos
pela digestão com as endonucleases EcoRI e CvQI, com os compostos por análise em gel de
poliacrilamida. As diamidinas DB889 e DB185 induziram consideráveis alterações na mobilidade dos
fragmentos. Além disso, incubando a rede intacta e purificada de kDNA com a DB75 e monitorando o
efeito por MF, obervarmos a capacidade desta DA de induzir um grande aumento da área da rede.
Em resumo, nossos resultados revelam que diamidinas e congêneres são capazes de induzir
profundas alterações na topologia do kDNA do T. cruzi sugerindo que esta estrutura pode ser um dos
possíveis alvos destes compostos. Entretanto, a localização preferencial dos compostos no kDNA,
assim como sua afinidade à esta estrutura e capacidade de alterar a mobilidade dos fragmentos em
géis de poliacrilamida não está correlacionada com sua atividade tripanocida. Estes dados sugerem
fortemente que outros fatores podem estar envolvidos no mecanismo de ação destes compostos,
operando de modo primário ou secundário a interação composto:kDNA. Outros estudos serão
necessários para melhor identificar os mecanismos envolvidos na ação destes compostos, visando
contribuir para o desenho racional de compostos líderes para o tratamento da doença de Chagas. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, is endemic in Latin America, affecting more de 15
million people. Due to the limited efficacy and considerable toxicity, the therapy for Chagas disease is
far from being considerable ideal and thus alternative drugs are urgently needed. In this context, with
the collaborations of medicinal chemistry groups, our aim was to investigate the trypanocidal activity,
selectivity, cellular targets and mechanisms of action of aromatic diamidines (ADs) and analogues.
First, we tested the trypanocidal effect of eleven ADs upon intracellular amastigotes and
trypomastigotes, their toxicity towards mammalian cells and their sub-cellular localization. Compounds
2, 5 and 7 were the most active, presenting IC50 values on the micromolar range and displaying high
selectivity indexes for both T. cruzi forms. Using fluorescence microscopy (FM), all the compounds
were localized in organelles rich in DNA, nucleus and mitochondrion (kDNA) and in bloodstream forms
treated with the compounds 5 and 7 we observed ultrastructural damages on mitochondrial organelle,
including kDNA disorganization. The accumulation of the diamidines was higher in the kDNA than in
the nucleus, but such accumulation could not be correlated with a higher trypanocidal activity. Next,
aiming to better understand the mechanism of action of diamidines and analogues, we investigated the
possible correlation between kDNA binding properties of thirteen compounds with their anti-T. cruzi
effect, through thermal denaturation (T m) and circular dichroism (CiD) studies. Our data demonstrated
using the purified kDNA of epimastigotes or a conserved synthetic parasite sequence of 22-mer
present in T. cruzi minicircles, that the strong interaction of the amidines with the kDNA is not a
determinant factor to the triggering of the trypanocidal activity. Our next step was the evaluation of
topological changes induced by ten aromatic compounds on T. cruzi kDNA, through gel mobility shifts
and FM. The eletrophoretic studies were conducted by the incubation of kDNA fragments obtained by
digestion with the endonucleases EcoRI e CvQI with the compounds and analysis by poliacrylamide
gel. The diamidines DB889 and DB185 induced substantial mobility shifts in the fragmented bands.
Additionally, by FM of whole kDNA network incubated with DB75 we observed the ability of this
diamidine to cause a striking expansion of the kDNA network area. Taken together our results suggest
that diamidines and related compounds provoke profound alterations in the normal topology of T. cruzi
kDNA suggesting that this structure may represent one of the potential targets of these compounds.
However, the compound preferential accumulation in kDNA, as well as their affinity and capability of
inducing topological changes in that structure is not correlated with their anti-T. cruzi activity. These
findings strongly suggest that other molecular mechanisms may be also operating primarily or
secondarily to the drug:KDNA interaction. Further studies are needed to better identify the mechanisms
involved in the activity of this class of chemical, aiming to contribute to the rational design of lead
compounds for the treatment of Chagas disease .
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/5688 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Daliry, Anissa |
| Contributors | Leon, Leonor Laura Pinto, Pacheco, Raquel da Silva, Carvalho, Tecia Maria Ulisses de, Souza, Elen Mello de, Waghabi, Mariana Caldas, Castro, Solange Lisboa de, Soeiro, Maria de Nazaré Correia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Anissa Daliry, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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