A significativa prevalência da infecção pelo HTLV-1/2 no Brasil tornou compulsória a triagem sorológica em bancos de sangue desde 1993. A realização de um diagnóstico eficaz e seguro desta infecção tem importância no correto aconselhamento dos pacientes, bem como na adoção de medidas preventivas em relação à transmissão do HTLV-1/2. Entretanto, a ineficiência dos testes confirmatórios disponíveis somado ao alto custo, são fatores limitantes para a conclusão segura do status clínico do paciente. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, padronizar e validar uma plataforma molecular (NAT) multiplex utilizando a metodologia de PCR em tempo real para o diagnóstico confirmatório e discriminatório da infecção pelo HTLV-1/2. Para tanto, foi padronizada a PCR em tempo real utilizando o sistema de sondas de hidrólise (TaqMan®) e a região gênica viral pol foi utilizada como alvo dessas reações. As reações foram otimizadas e validadas em amostras de DNA de controles positivos e negativos, amostras de DNA obtidas a partir do sangue total de indivíduos infectados pelo HTLV-1/2, candidatos à doação de sangue e de pacientes infectados por outras viroses (HIV, HBV e HCV). Após a padronização, a plataforma molecular foi validada em relação aos seguintes parâmetros: sensibilidade analítica, sensibilidade diagnóstica, especificidade analítica, especificidade diagnóstica, precisão e robustez. O limite de detecção do teste (LoD) foi de 3,85 cópias/reação para HTLV-1 e 10,88 cópias/reação para HTLV-2. Para a especificidade, não foi observada reação cruzada com os vírus HAV, HBV, HCV, HIV-1 e HIV-2 e B19V obtidos a partir de um painel de referência viral e nem com amostras de indivíduos portadores de HIV, HBV ou HCV. A sensibilidade diagnóstica foi de 94,6% para HTLV-1 e 78,6% para HTLV-2. O coeficiente de variação encontrado no parâmetro precisão foi de até 0,475%. A metodologia desenvolvida é uma ferramenta simples, de baixo custo, sensível e altamente específica, portanto, adequada para detecção e discriminação da infecção por este retrovírus. A padronização desta plataforma tem um importante impacto no fortalecimento da capacitação tecnológica nacional. Além disso, propõe seu uso no algoritmo diagnóstico, o qual permitirá a conclusão segura do diagnóstico do HTLV-1/2. / The significant prevalence of HTLV-1/2 infection in Brazil has turned the serological testing for this virus mandatory in national blood banks since 1993. The performance of efficient and safe diagnosis of this infection has importance on the correct counseling of the patients and the prevention of the transfusion/hemoderivatives transmitted HTLV-1/2 infection. However, the inefficiency of the available confirmatory tests combined with their high cost present limiting factors for adequate conclusions over the clinical status of the patient. A safe diagnosis of the HTLV-1/2 infection is of crucial importance for the correct counseling of the patients and prevention of the transmission of the infection by blood transfusions, breastfeeding and solid organ transplantations. Therefore, the objective of this study was to develop, optimize and validate a molecular multiplex platform (NAT) utilizing the real-time PCR methodology for confirmatory and discriminatory diagnosis of the HTLV-1/2 infection. DNA samples obtained from HTLV-1/2 positive patients, blood donor candidates, and HIV, HBV and HCV infected patients were used in this study. The real-time PCR was optimized using the TaqMan® system (hydrolysis probes) and the pol gene was a target for real-time amplification. After optimization, the molecular platform was validated by analysis of the analytic and diagnostic sensitivity, analytic and diagnostic specificity, precision, and robustness. The detection limit (LoD) of the test was 3.85 copies/reaction for HTLV-1 and 10.88 copies/reaction for HTLV-2. Evaluation of the specificity did not demonstrate cross reaction with human viruses like HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2 and B19V obtained from a diagnostic panel and also with samples obtained from HIV, HBV or HCV positive individuals. The diagnostic sensitivity was 94.6% for HTLV-1 and 78.6% for HTLV-2. The estimated variation coefficient of the precision analysis was not more than 0.475%. Therefore, this methodology presents simple, inexpensive, sensitive and highly specific test, and can be used adequately for the detection and discrimination of this retroviral infection. The optimization of this molecular platform have important impact on the improvement of the technologic capability and it can be used for the definition of a national diagnostic algorithm which will permit a safe conclusion of the HTLV-1/2 diagnosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-17042015-143833 |
| Date | 10 October 2014 |
| Creators | Maurício Cristiano Rocha Júnior |
| Contributors | Simone Kashima Haddad, Newton Satoru Odashima |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Biociências Aplicadas à Farmácia, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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