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Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Existem diversas doenças crônico degenerativas que afetam diretamente a capacidade contrátil e força muscular da musculatura esquelética e/ou cardíaca, sejam elas doenças de cunho inflamatório ou genético. Dentre elas, podemos destacar as distrofias musculares e a miopatias inflamatórias (MI), que além da fraqueza progressiva e perda da resistência dos músculos esqueléticos, exibem importante infiltração inflamatória. A infiltração inflamatória gera danos secundários ao tecido muscular, agravando a doença com a perda da força muscular. A histopatologia do músculo lesionado é caracterizada pela presença de células inflamatórias, tais como linfócitos T, macrófagos e células dendríticas (DC). Em diversas MI, as DC são encontradas circundando fibras musculares lesionadas ou não ou mesmo invadindo fibras necróticas e não necróticas. Esta propriedade ilustra a importância da interação entre as DC e as células musculares e que exercem potencial papel na progressão das doenças musculares degenerativas. Além disso, as DC são células chave na indução da resposta imune adaptativa assim como na integração das respostas inata e específica. Entretanto a interação existente entre as DC e os mioblastos, células responsáveis pela regeneração do tecido muscular, ainda não foi claramente determinada. O objetivo desse estudo é, portanto, determinar se há interação entre as DC e mioblastos, e também que alterações morfológicas e funcionais ocorre nos mioblastos após a interação
Para responder o objetivo do trabalho realizamos co-cultivos in vitro de mioblastos e DC. Para tal utilizamos DC imaturas (iDC), cultivadas apenas com meio de cultura, e DC ativadas (actDC), cultivadas ativadas por LPS. Por microscopia de luz e eletrônica observamos que as iDC e actDC aderem aos mioblastos, principalmente às actDC. Nós observamos por microscopia óptica e eletrônica que as DC aderem firmemente aos mioblastos nos estágios de proliferação e diferenciação. No estágio de diferenciação, o co-cultivo com iDC e actDC observamos que as miofibras formadas foram mais finas e desorganizadas, principalmente com actDC. Além disso também observamos a diminuição na formação de miotubos e diminuição na de myoD e miogenina, com diferenças mais pronunciadas no co-cultivo com actDC. No estágio de proliferação o cocultivo com iDC e actDC aumentou a marcação de mioblastos BrdU+, principalmente no co-cultivo com actDC. A expressão de fibronectina, caderina e laminina no co-cultivo não foi alterado. Entretanto no estágio de diferenciação, observamos por imunofluorescência, que a marcação para aactinina, b-catenina e laminina não foi alterada. Fato interessante foi a indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), uma enzima que degrada o aminoácido triptofano e promove imunotolerância foi observada marcação nos mioblastos. Quando realizamos o co-cultivo, principalmente com actDC, houve aumento na expressão de IDO nas células musculares tanto no estágio de proliferação como no de diferenciação. Analisamos que houve diminuição na capacidade de migração dos mioblastos no cocultivo com iDC e actDC, e que a diferença é pronunciada com actDC. Por fim, houve aumento na liberação de citocinas e aumento na expressão de HLA-ABC e HLA-DR no co-cultivo com actDC. Nos dados sugerem que o co-cultivo de DC e mioblastos alteram os mioblastos e que essa mudança indica uma contribuição das DC na evolução das MI / There are several chronic degenerative diseases that are either inflammatory diseases or
genetic diseases which directly affect the contractile capacity and muscle strength in skeletal muscle
and / or the heart. It is possible to highlight the muscular dystrophies and inflammatory myopathies
(IM), which have clinical symptoms such as progressive weakness and loss of skeletal muscle
strength and the exhibition of significant inflammatory infiltration. Inflammatory infiltration
generates secondary muscle tissue damage and exacerbates the progression of the disease and
muscle weakness. The sick muscle histopathology is characterized by the presence of inflammatory
cells such as T lymphocytes, macrophages and dendritic cells (DC). In several IM, DC are found
surrounding or even invading necrotic and non-necrotic muscle fibers and this facet illustrates the
importance of the interaction between the aforementioned cells and the potential in the progression
of degenerative muscle diseases. Furthermore, DC cells are key for the induction of the adaptive
immune response as well as the integration of innate and specific responses. However the
interaction between DCs and myoblasts, the cells which are responsible for muscle tissue
regeneration, has not been clearly determined. Therefore, the aim of this study is to determine
whether there is interaction between DCs and myoblasts and also any morphological and functional
changes that occur in the myoblasts as a result of the interaction. In order to answer our question,
we designed an in vitro co-culture of myoblasts plus DCs. We used immature DCs (iDC) cultured
with medium only and activated DCs (actDC) cultured with medium and LPS. We observed by
optical and electron microscopy that DCs have a tight adhesion with myoblasts in the proliferation
or differentiation phases. Upon the co-culturing of iDC and actDC in the differentiation phase, we
observed that the myofibers formed were thinner and more disorganized, especially in the actDC
co-culture. In addition, we also observed a decrease in myotube formation, and a decrease in myoD
and myogenin expression in the co-cultures of iDC and actDC. Furthermore, the aforementioned
decreases in formation and expression were more pronounced in the actDC co-culture. During
myoblast proliferation the co-culturing of iDC and actDC increased the staining in myoblasts for
BrdU, especially in myoblasts from the actDC co-culture. In addition, the expression of fibronectin,
cadherin and laminin in the co-cultures did not change. However, during myoblast differentiation,
we observed via immunoflourescence that the staining of α-actinin, β-catenin, and laminin was
unaltered in the different co-cultures. Interestingly, indoleamine 2,3 dioxigenase (IDO), an enzyme
that degrades the essential amino acid tryptophan and promotes immune tolerance, was found to be
expressed in myoblasts. Moreover, this expression was increased during co-culture, in both the
proliferation and differentiation phases. We also analyzed the myoblasts migration ability and
observed that myoblast migration is decreased during co-culture. The decrease in migration was
greater in the actDC co-culture than the iDC. Finally, there was a greater release of cytokines and
increased expression of HLA-ABC and HLA-DR in the co-culture with actDC. In conclusion, our
data suggests that the use of co-culture changes the myoblast profile and indicates that DCs can
contribute to IM evolution.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12117 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Alves, Leandro Ladislau |
| Contributors | Cruz, Alda Maria da, Vallochi, Adriana, Mermelstein, Claudia, Riederer, Ingo, Faria Neto, Hugo Caire de Castro, Savino, Wilson |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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