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Role of the cotransporter KCC2 in cortical excitatory synapse development and febrile seizure susceptibility

Le co-transporteur KCC2 spécifique au potassium et chlore a pour rôle principal de réduire la concentration intracellulaire de chlore, entraînant l’hyperpolarisation des courants GABAergic l’autorisant ainsi à devenir inhibiteur dans le cerveau mature. De plus, il est aussi impliqué dans le développement des synapses excitatrices, nommées aussi les épines dendritiques. Le but de notre projet est d’étudier l’effet des modifications concernant l'expression et la fonction de KCC2 dans le cortex du cerveau en développement dans un contexte de convulsions précoces.
Les convulsions fébriles affectent environ 5% des enfants, et ce dès la première année de vie. Les enfants atteints de convulsions fébriles prolongées et atypiques sont plus susceptibles à développer l’épilepsie. De plus, la présence d’une malformation cérébrale prédispose au développement de convulsions fébriles atypiques, et d’épilepsie du lobe temporal. Ceci suggère que ces pathologies néonatales peuvent altérer le développement des circuits neuronaux irréversiblement. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne sont pas encore compris. Nous avons pour but de comprendre l'impact des altérations de KCC2 sur la survenue des convulsions et dans la formation des épines dendritiques.
Nous avons étudié KCC2 dans un modèle animal de convulsions précédemment validé, qui combine une lésion corticale à P1 (premier jour de vie postnatale), suivie d'une convulsion induite par hyperthermie à P10 (nommés rats LHS). À la suite de ces insultes, 86% des rats mâles LHS développent l’épilepsie à l’âge adulte, au même titre que des troubles d’apprentissage. À P20, ces animaux presentent une augmentation de l'expression de KCC2 associée à une hyperpolarisation du potentiel de réversion de GABA. De plus, nous avons observé des réductions dans la taille des épines dendritiques et l'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs miniatures, ainsi qu’un déficit de mémoire spatial, et ce avant le développement des convulsions spontanées. Dans le but de rétablir les déficits observés chez les rats LHS, nous avons alors réalisé un knock-down de KCC2 par shARN spécifique par électroporation in utero. Nos résultats ont montré une diminution de la susceptibilité aux convulsions due à la lésion corticale, ainsi qu'une restauration de la taille des épines. Ainsi, l’augmentation de KCC2 à la suite d'une convulsion précoce, augmente la susceptibilité aux convulsions modifiant la morphologie des épines dendritiques, probable facteur contribuant à l’atrophie de l’hippocampe et l’occurrence des déficits cognitifs.
Le deuxième objectif a été d'inspecter l’effet de la surexpression précoce de KCC2 dans le développement des épines dendritiques de l’hippocampe. Nous avons ainsi surexprimé KCC2 aussi bien in vitro dans des cultures organotypiques d’hippocampe, qu' in vivo par électroporation in utero. À l'inverse des résultats publiés dans le cortex, nous avons observé une diminution de la densité d’épines dendritiques et une augmentation de la taille des épines. Afin de confirmer la spécificité du rôle de KCC2 face à la région néocorticale étudiée, nous avons surexprimé KCC2 dans le cortex par électroporation in utero. Cette manipulation a eu pour conséquences d’augmenter la densité et la longueur des épines synaptiques de l’arbre dendritique des cellules glutamatergiques. En conséquent, ces résultats ont démontré pour la première fois, que les modifications de l’expression de KCC2 sont spécifiques à la région affectée. Ceci souligne les obstacles auxquels nous faisons face dans le développement de thérapie adéquat pour l’épilepsie ayant pour but de moduler l’expression de KCC2 de façon spécifique. / The potassium-chloride cotransporter KCC2 decreases intracellular Cl- levels and renders GABA responses inhibitory. In addition, it has also been shown to modulate excitatory synapse development. In this project, we investigated how alterations of KCC2 expression levels affect these two key processes in cortical structures of a normal and/or epileptic developing brain.
First, we demonstrate that KCC2 expression is altered by early-life febrile status epilepticus. Febrile seizures affect about 5% of children during the first year of life. Atypical febrile seizures, particularly febrile status epilepticus, correlate with a higher risk of developing cognitive deficits and temporal lobe epilepsy as adults, suggesting that they may permanently change the developmental trajectory of neuronal circuits. In fact, the presence of a cerebral malformation predisposes to the development of atypical febrile seizures and temporal lobe epilepsy. The mechanisms underlying these effects are not clear. Here, we investigated the functional impact of this alteration on subsequent synapse formation and seizure susceptibility.
We analyzed KCC2 expression and spine density in the hippocampus of a well-established rodent model of atypical febrile seizures, combining a cortical freeze lesion at post-natal day 1 (P1) and hyperthermia-induced seizure at P10 (LHS rats). 86% of these LHS males develop epilepsy and learning and memory deficits in adulthood. At P20, we found a precocious increase in KCC2 protein levels, accompanied by a negative shift of the reversal potential of GABA (EGABA) by gramicidin-perforated patch. In parallel, we observed a reduction in dendritic spine size by DiI labelling and a reduction of miniature excitatory postsynaptic current (mEPSC) amplitude in CA1 pyramidal neurons, as well as impaired spatial memory. To investigate whether the premature expression of KCC2 played a role in these alterations in the LHS model, and on seizure susceptibility, we reduced KCC2 expression in CA1 pyramidal neurons by in utero electroporation of shRNA using a triple-probe electrode. This approach lead to reduced febrile seizure susceptibility, and rescued spine size shrinkage in LHS rats. Our results show that an increase of KCC2 levels induced by early-life insults affect seizure susceptibility and spine development and may be a contributing factor to the occurrence of hippocampal atrophy and associated cognitive deficits in LHS rats.
Second, we investigated whether KCC2 premature overexpression plays a role in spine alterations in the hippocampus. We overexpressed KCC2 in hippocampal organotypic cultures by biolistic transfection and in vivo by in utero electroporation. In contrast to what was previously published, we observed that both manipulations lead to a decrease in spine density in the hippocampus, as well as an increase in spine head size in vivo. In fact, it has been previously shown that overexpressing KCC2 leads to an increase of spine density in the cortex in vivo. To prove that this discrepancy is due to brain regional differences, we overexpressed KCC2 in the cortex by in utero electroporation, and similarly found an increase in spine density and length. Altogether, our results demonstrate for the first time, that alterations of KCC2 expression are brain circuit-specific. These findings highlights the obstacles we will face to find adequate pharmacological treatment to specifically modulate KCC2 in a region-specific and time-sensitive manner in epilepsy.

Identiferoai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/13979
Date08 1900
CreatorsAwad, Patricia Nora
ContributorsDi Cristo, Graziella, Carmant, Lionel
Source SetsUniversité de Montréal
LanguageEnglish
Detected LanguageFrench
TypeThèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation

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