Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética causadora da criptococose, doença que acomete diferentes órgãos de pacientes imunocompetentes, entre eles, pulmões, pele e sistema nervoso central. Durante o processo infeccioso, o fungo expressa diversos fatores de virulência, como a produção de melanina e cápsula polissacarídica, além de possuir a capacidade de replicar-se no interior de macrófagos. Em contrapartida, as células do hospedeiro também possuem estratégias para conter a disseminação do patógeno, uma delas é a imunidade nutricional, na qual ocorre redução da disponibilidade de nutrientes no sítio de infecção. A disponibilidade de zinco é um fator crucial para o desenvolvimento de uma infecção fúngica, mesmo assim, pouco se sabe sobre o metabolismo desse metal na espécie C. gattii. No presente trabalho, primeiramente, descrevemos o fator de transcrição Zap1 em C. gattii, a partir da análise in silico foi identificado um ortólogo do gene regulador da homeostase de zinco ZAP1 de Saccharomyces cerevisiae do genoma de C. gattii. Foram realizadas análises de expressão, demonstrando que o gene selecionado possui sua expressão aumentada na condição de privação de zinco, comprovando assim, sua relação com a homeostase desse metal. Para caracterizar funcionalmente a proteína Zap1, linhagens mutante e mutante complementada para o gene ZAP1 foram construídas e caracterizadas. A diminuição dos níveis de transcritos dos genes codificadores para os transportadores de zinco da família ZIP na linhagem mutante, concluímos que Zap1 regula positivamente a expressão desses genes. Na caracterização fenotípica, a linhagem mutante zap1Δ demonstrou maior sensibilidade à condição de privação de zinco do que a linhagem selvagem e mutante complementada, além de demonstrar altos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROs) e maior sensibilidade as espécies reativas de nitrogênio (ERNs) características que explicam a menor virulência da linhagem mutante quando comparada com a linhagem selvagem. Por meio da análise do transcriptoma demonstramos que Zap1 regula a expressão de genes envolvidos no metabolismo de zinco, estresse oxidativo e de genes codificadores para proteínas ligadoras de zinco. Secundariamente, na caracterização inicial de sistemas de aquisição de zinco em C. gattii, foram realizadas análises por PCR quantitativo em tempo real para avaliar os níveis de transcritos dos genes que codificam para transportadores de zinco da família ZIP. Um aumento significativo nos níveis de transcritos referentes ao gene ZIP3 (CNBG_5361), foi observado quando C. gattii foi cultivado em meio definido contendo o quelante de ferro BPDS ou o quelante de zinco TPEN, quando comparados à condição controle. Este fato sugere que o transportador Zip3 pode apresentar baixa seletividade, podendo transportar outros metais, em contraste aos transportadores Zip1 e Zip2, cuja modulação da expressão por BPDS foi menos acentuada. / Cryptococcus gattii is a basidiomycetous yeast that causes cryptococcosis, a lifethreatening disease that can affect different organs of immunocompetent hosts, including, lungs, skin and central nervous system. During the infection process, the fungus express several virulence factors, such as melanin production and polysaccharide capsule, besides the ability to replicate inside macrophages. In contrast, the host cells express strategies to stop the spread of the pathogen, one of them is nutritional immunity, reducing nutrient availability in the infection site. Zinc availability is a crucial factor for fungal infection development, nevertheless, little is known about zinc metabolism in C. gattii. In the present work, firstly, we described Zap1 transcription factor in C. gattii. In silico analyses identified a Saccharomyces cerevisiae ZAP1 ortholog in C. gattii genome. Expression analyses demonstrated that, ZAP1 is positively regulated in zinc deprivation condition, confirming that the selected gene is involved in zinc metabolism. With the purpose to characterize the role of Zap1 in zinc metabolism, mutant and complemented strains were constructed and characterized. Expression analyses demonstrated that genes codifying for ZIP family of zinc transporter are up regulated by Zap1. On phenotypic characterization, mutant strain demonstrated higher sensibility to zinc deprivation condition when compared to wild type or complemented strain. Moreover, mutant strain demonstrated higher levels of reactive oxygen species (ROS) and higher sensibility to reactive nitrogen species (RNS). Transcriptomic analyses demonstrated that Zap1 regulates the expression of genes involved on zinc homeostasis, oxidative stress and genes codifying for zinc-binding proteins. Taken together, these results, explain the low virulence of mutant strain when compared to wild type and complemented strain. On the second part, on initial characterization of ZIP family of zinc transporters, relative transcript levels of ZIP family codifying genes was measured on different conditions. ZIP3 (CNBG_5361) demonstrated higher transcript levels when C. gattii cells were cultured on iron deprivation condition, for that, iron chelating agent (BPDS) was add to the medium. These results suggest that, Zip3 may present low selectivity, and may carry other metal, in contrast to Zip1 and Zip2, that expression modulation by BPDS was less pronounced.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume56.ufrgs.br:10183/69698 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Schneider, Rafael de Oliveira |
| Contributors | Staats, Charley Christian, Vainstein, Marilene Henning |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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