Secondary structure dynamics of biopolymers play a vital role in many of the complex processes within a cell. However, due to the substantial number of atoms in the involved biopolymers along with the multitude of interactions that occur between the molecules, understanding these processes in detail is challenging and often involves computationally demanding simulations. In this thesis, the secondary structure dynamics of three different biopolymer systems were modeled using a single approach, which is based on intuitive principles that facilitate the interpretation. To this end, the kinetic behavior of each system was experimentally determined, and described by simplified reaction schemes, which were then connected to Markov chain models encompassing all principal secondary structural conformations.
Firstly, we investigated the toehold-mediated strand displacement reaction, which is widely applied in nanotechnology to create DNA-based nano-devices and biochemical reaction networks. Our model correctly described the impact of base pair mismatches on the kinetics of these reactions, as measured by bulk fluorescence experiments. Additionally, it revealed that incumbent dissociation, base pair fraying, and internal loop formation are important processes during strand displacement. Furthermore, we established two dissipative elements to enhance temporal control over toehold-mediated strand displacement reactions. The first element allowed a reversible and repeatable incumbent strand release, whereas the second element provided the possibility to start the displacement reaction after a programmable temporal delay.
Secondly, we studied the target recognition by the CRISPR-Cas effector complex Cascade, a highly promising protein for applications in genome engineering. Our model successfully reproduced all aspects of the torque- and mismatch-dependent R-loop formation time by Cascade obtained by single-molecule torque and bulk fluorescence measurements. Furthermore, we demonstrated that the seed effect observed for Cascade results from DNA supercoiling, rather than a structural property of the protein complex.
Lastly, we explored the folding/unfolding of α-helices, which plays a critical role in the folding and function of proteins. Our model accurately described α-helix unfolding kinetics obtained by fast triplet-triplet energy transfer. Moreover, we showed that the complex α-helix unfolding does not follow a simple Einstein-type diffusion but is a combination of the sub-diffusive boundary diffusion and the rather peptide-length-independent coil nucleation.
The presented models enabled access to the diverse timescales of the characterized processes, which are generally difficult to access experimentally, despite utilizing just a single approach. In particular, we obtained: tens of microseconds for the branch migration step time of the toehold-mediated strand displacement, hundreds of microseconds for the R-loop formation steps by Cascade, and tens of nanoseconds for folding or unfolding of an α-helix by a single residue. Given the simplicity and accessibility of the established models, we are confident that they will become useful tools for researchers to analyze the dynamics of biomolecules, and anticipate that similar modeling approaches can be applied to other biopolymer systems, being well-described by probabilistic models. / Die Sekundärstrukturdynamik von Biopolymeren spielt eine entscheidende Rolle bei vielen komplexen Prozessen innerhalb einer Zelle. Aufgrund der beträchtlichen Anzahl von Atomen in den beteiligten Biopolymeren und der Vielzahl an Wechselwirkungen zwischen den Molekülen ist es jedoch eine Herausforderung diese Prozesse im Detail zu verstehen, und erfordert oft rechenintensive Simulationen. In dieser Arbeit wurde die Sekundärstrukturdynamik von drei verschiedenen Biopolymersystemen mit einem einzigen Ansatz modelliert, welcher auf intuitiven Prinzipien beruht und somit eine erleichterte Interpretation der Ergebnisse ermöglicht. Hierzu wurde das kinetische Verhalten jedes Systems experimentell bestimmt und durch vereinfachte Reaktionsschemata beschrieben. Diese wurden anschließend mit Markov-Kettenmodellen verknüpft, welche alle wichtigen Konformationen der Sekundärstruktur abbilden.
Als erstes System untersuchten wir die DNA Strangaustauschreaktion, welche in der Nanotechnologie häufig zur Herstellung von DNA-basierten Nanomaschinen und biochemischen Reaktionsnetzwerken eingesetzt wird. Unser Modell beschrieb die durch Ensemble-Fluoreszenz-Experimente gemessenen Auswirkungen von Basenfehlpaarungen auf die Kinetik dieser Reaktionen korrekt. Des Weiteren zeigte sich, dass die vorzeitige Strangablösung, das Ausfransen von Basenpaaren und die Bildung interner Schleifen wichtige Prozesse während des Strangaustausches sind. Darüber hinaus konnten wir zwei dissipative Elemente etablieren, um die zeitliche Kontrolle über die Strangaustauschreaktionen zu verbessern. Das erste Element ermöglicht eine reversible und wiederholbare Strangablösung, während das zweite Element die Möglichkeit bietet die Strangaustauschreaktionen nach einer programmierbaren zeitlichen Verzögerung zu starten.
Zweitens untersuchten wir den Zielerkennungsprozess durch den CRISPR-Cas Komplex Cascade, ein vielversprechendes Protein für Anwendungen in der Genomtechnologie. Unser Modell reproduzierte erfolgreich alle Aspekte der torsions- und fehlpaarungs-abhängigen R-Schleifenbildung durch Cascade, welche durch Einzelmolekül-Torsions- und Ensemble-Fluoreszenz-Messungen ermittelt wurden. Zusätzlich konnten wir nachweisen, dass der für Cascade beobachtete „seed“-Effekt auf DNA-Verdrehung und nicht auf eine strukturelle Eigenschaft des Proteinkomplexes zurückzuführen ist.
Schließlich untersuchten wir die Faltung/Entfaltung von α-Helices, welche eine entscheidende Rolle bei der Faltung und Funktion von Proteinen spielen. Unser Modell beschrieb die durch schnelle Triplett-Triplett-Energietransfer Experimente ermittelte α-Helix-Entfaltungskinetik exakt. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die komplexe α-Helix-Entfaltung nicht einer einfachen Diffusion vom Einstein-Typ folgt, sondern eine Kombination aus subdiffusiver Grenzdiffusion und der eher peptidlängenunabhängigen Coil-Nukleation ist.
Obwohl nur ein einziger Ansatz verwendet wurde, ermöglichten die vorgestellten Modelle den Zugang zu den vielschichtigen Zeitskalen der charakterisierten Prozesse, welche im Allgemeinen experimentell schwer zugänglich sind. Insbesondere konnten die folgenden zeitlichen Bereiche bestimmt werden: Dutzende von Mikrosekunden für die Schrittzeit der Strangaustauschreaktion, Hunderte von Mikrosekunden für die Schritte der R-Schleifenbildung durch Cascade, und Dutzende von Nanosekunden für die Faltung oder Entfaltung einer α-Helix um ein einzelnes Segment. Angesichts der Simplizität und Zugänglichkeit der etablierten Modelle sind wir zuversichtlich, dass sie zu nützlichen Werkzeugen für Forscher werden, um die Dynamik von Biomolekülen zu analysieren. Zusätzlich gehen wir davon aus, dass ähnliche Modellierungsansätze auf andere Biopolymersysteme angewendet werden können, sofern sie gut durch probabilistische Modelle beschrieben werden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:90134 |
| Date | 26 February 2024 |
| Creators | Irmisch, Patrick |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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