A Crotoxina, o principal componente do veneno de Crotalus durissus terrificus, vem sendo estudada desde 1938. É um complexo polipeptídico natural com grande potencial farmacológico especialmente por seu efeito antitumoral, propriedade que tem despertado o interesse para o diagnóstico e o tratamento do câncer. Entretanto, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação e os sítios com os quais interage em células tumorais. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o mais comum entre as mulheres. Cerca de 30 a 60% dos tumores mamários apresentam expressão aumentada de receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFR), uma proteína transmembrana que desencadeia a proliferação celular. A partir de dados da literatura mostrando que o efeito antitumoral da Crotoxina é mais potente em células que superexpressam EGFR, estabeleceu-se o objetivo deste trabalho: avaliar os efeitos citotóxicos desse polipeptídeo sobre os tumores de origem mamária MCF-7 (carcinoma humano) e Ehrlich (carcinoma murino ascítico) e realizar um estudo de interação molecular da Crotoxina com células de tumor de Ehrlich. Inicialmente, a Crotoxina foi radiomarcada com iodo-125 (125I-Crotoxina) e iodo-131 (131I-Crotoxina). Ensaios de saturação e competição foram realizados para caracterizar a interação da Crotoxina in vitro, enquanto que a interação in vivo foi avaliada através da biodistribuição e obtenção de imagens em tomografia por emissão de fóton único (SPECT) do composto radiomarcado em camundongos portadores de tumor de Ehrlich. Os resultados evidenciaram que o polipeptídeo apresentou um potente efeito citotóxico sobre as células de tumor de Ehrlich, com valor de DL50 in vitro (concentração do composto que produziu 50% de morte celular) próximo de 1 micromolar, mas não apresentou efeito significativo sobre a linhagem MCF-7. Alterações morfológicas nas células de tumor de Ehrlich tratadas com Crotoxina sugerem indução de morte celular programada. A interação da 125I-Crotoxina com as células de Ehrlich foi saturável com cerca de 70% de especificidade, com Kd= 24,98 nmol/L e Bmax= 16570 sítios/célula para sítios de baixa afinidade e com Kd= 0,06 nmol/L e Bmax=210 sítios/célula para sítios de alta afinidade. O polipeptídeo radiomarcado apresentou menor especificidade (cerca de 37%) para a linhagem MCF-7.
O EGF competiu com 20% dos sítios específicos da 125I-Crotoxina indicando que Crotoxina e EGF compartilham parcialmente sítios específicos em células de Ehrlich. Através do estudo de biodistribuição, observou-se que houve captação significativa de 125I-Crotoxina no tumor (razão tumor/músculo esquelético de 18,55) no período de 3 horas após administração deste composto. As imagens SPECT também evidenciaram captação diferenciada pelo tumor, mostrando interação in vivo da 131I-Crotoxina com células de tumor de Ehrlich. O conjunto dos resultados sugere que Crotoxina apresenta potente efeito antitumoral sobre células de Ehrlich e que este efeito é devido pelo menos parcialmente à interação específica com sítios de alta e baixa afinidade. Os sítios de baixa afinidade se correlacionam com o EGFR e os de alta afinidade ainda necessitam de mais investigação para melhor caracterização. Estes resultados corroboram o potencial da Crotoxina como ferramenta para radiodiagnóstico capaz de diferenciar células tumorais. / Crotoxin, the main component of Crotalus durissus terrificus snake venom, has been studied since 1938. It is a natural polypeptidic complex with pharmacological potential because of its antitumoral properties wich has attracted great interest for diagnosis and therapy of oncological deseases. However, Crotoxin mechanism of action and sites of specific interaction on tumor cells are still misunderstood. Breast cancer is the second most frequent type in the world and the most common cancer in women. About 30 to 60% of mammary tumors overexpress epidermal growth factor receptor (EGFR), a transmembrane protein related to cell proliferation. Since literature has reported that Crotoxin antitumoral effect is more potent on cells with EGFR overexpression the objectives of this work were to evaluate Crotoxin cytotoxic effects on mammary tumor cells human breast carcinoma (MCF-7) and Ehrlich tumor cells (murine ascitics carcinoma), and to investigate the specific molecular interaction of Crotoxin on Ehrlich tumor cells. Inititally, Crotoxin was radiolabelled with iodine-125 (125I-Crotoxin) and iodine-131 (131I-Crotoxin). Saturation and competition assay were carried out to characterize Crotoxin in vitro interaction; Crotoxin biodistribution studies and single-photon emission computed tomography (SPECT) of mice bearing Ehrlich tumor have been evaluated to describe in vivo interaction. Our results showed that Crotoxin presented cytotoxic effect against Ehrlich with DL50 in vitro (concentration of compound which is lethal for 50% of cells) of about one micromolar, but did not present significative effect against MCF-7. Morphological alterations characteristic of apoptosis suggests programmed cell death. 125I-Crotoxin interaction with Ehrlich tumor cells was saturable with approximately 70% specificity, and presented Kd=24.98 nmol/L and Bmax=16,570 sites/cell for low affinity binding sites and Kd=0.06 nmol/L e Bmax=210 sites/cell high affinity binding sites; moreover, the radiolabeled polypeptide interaction showed low specificity toward to MCF-7 (37%). EGF reduced 20% of 125I-Crotoxin specific binding, so specific binding sites of Crotoxin on Ehrlich tumor cells partially overlap to EGFR. Crotoxin biodistribution studies showed significant uptake in the tumor paw (tumor/skeletal muscle ratio= 18.55), three hours after administration.
SPECT imaging also showed tumor uptake confirming in vivo interaction with Ehrlich tumor cells. Crotoxin had an antitumoral effect on Ehrlich tumor cells and this action is due, at least partially, to the specific interaction with low and high affinity binding sites. Low affinity binding sites correlate EGFR and high affinity binding sites still need identification. These results confirm Crotoxin as a template for radiopharmaceutical design for cancer diagnosis and as a tool for cancer studies, increasing its biotechnological potential.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:bdtd.cdtn.br:80 |
| Date | 28 January 2010 |
| Creators | Marina Bicalho Silveira |
| Contributors | Raquel Gouvêa dos Santos, Maria José Neves, Yara Cury, Maria Helena de Lima Perez Garcia |
| Publisher | CNEN - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, Belo Horizonte, CTRA - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, CDTN, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do CDTN, instname:Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, instacron:CDTN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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