Morbus Cushing ist die häufigste Ursache für endogenes Cushing-Syndrom und führt auf Grund eines kortikotropen Hypophysenadenoms zu einem Glucocorticoid Überschuss und wiederum zu einer hohen Morbidität und Mortalität. Die Ursache hierfür sind unter anderem somatische Mutationen in den Deubiquitinasen USP8 und USP48. Das Ziel dieser Arbeit war es mittels der CRISPR/Cas9-Methode, die Mutationen USP8 und USP48 in Zelllinien zu etablieren und diese für Cushing-Syndrom Analysen zu verwenden. Hierfür wurden in dieser Arbeit gRNAs für USP8 und USP48 designt, welche anschließend in die humane embryonale Zelllinie HEK293AD Zellen transfiziert wurden. Diese Zellen wurden zu monoklonalen Zellen vereinzelt. Ziel war einen Knock-out von USP8 bzw. USP48 zu generieren. Es konnte ein erfolgreicher Zellklon generiert werden mit einem Knock-out von USP48. Ebenfalls konnte ein Genomediting von USP8 in Exon 20 durchgeführt werden. Zusammenfassend konnte die CRISPR/Cas9 Methode für ein M. Cushing-Zellmodells etabliert und eine gute Ausgangsbasis für weitere Experimente (z.B. ein gezielter Knock-in von USP8- und USP48- Mutationen) generiert werden. / Cushing disease (CD) is the most common reason for endogenous Cushing syndrome (CS). It is caused by corticotrope adenoma of the pituitary resulting in hypercortisolism that is associated with high morbidity and mortality. One of the underlying reasons are the activating mutations of the deubiquitinase USP8 and USP48. The objective of this work was to establish the USP8 and USP48 mutations in cell lines by the CRISPR/Cas9 method in order to use them for further CS analyses. Therefore, we designed gRNAs against USP8 and USP48 which were transfected into the human embryonal cell line of HEK293AD cells. Those cells were separated to generate monoclonal cell lines entailing the knock-out of either USP8 or USP48. We successfully provided a cell clone with a knock-out of USP48. Furthermore, we were able to edit the genome of USP8 in exon 20. In summary we were able to establish the CRISPR/Cas9 method for a CD cell model and provided a good baseline for further experiments (i.e., creating a knock-in of USP8 and USP48 mutations).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:23450 |
| Date | January 2022 |
| Creators | Rehm, Alexandra |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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