Einleitung
Der Einsatz von Stammzellen als Grundlage neuer therapeutischer Strategien wird bereits seit über 25 Jahren intensiv erforscht. Stammzellen sind in der Lage, in verschiedene funktionale Zelltypen auszudifferenzieren und verfügen über ein enormes Proliferationspotential (NAM et al. 2015). Ausgehend von den Fähigkeiten von Stammzellen sehen Forscher und Kliniker erstmals eine realistische Möglichkeit, kurative Therapieoptionen für Erkrankungen zu entwickeln, die bisher als schwer behandelbar oder sogar unheilbar angesehen wurden. Davon könnten insbesondere Patienten chronisch-degenerativer neurologischer und zerebrovaskulärer Erkrankungen, einschließlich der großen Anzahl an Schlaganfallopfern, profitieren. Schlaganfälle repräsentieren eine der häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt (LOPEZ et al. 2006). Ein Drittel der betroffenen Patienten verstirbt innerhalb eines Jahres, während etwa 40% von dauerhaften Behinderungen betroffen sind (MOZAFFARIAN et al. 2015). Trotz intensiver Forschung existieren neben der systemischen Thrombolyse, die auf einen engen Zeitraum von maximal 4,5 Stunden nach dem Akutereignis beschränkt ist, keine zugelassenen Therapieoptionen (HACKE et al. 2008, SAVER et al. 2009). Zelltherapeutische Strategien zur Behandlung des Schlaganfalls werden daher als besonders vielversprechend angesehen (ANDRES et al. 2011). Neben den bereits gesicherten Erkenntnissen zur stammzelltherapeutischen Sicherheit und Wirksamkeit aus Studien unter Einsatz gängiger Nagermodellen (BLISS et al. 2006, JOO et al. 2013) wird insbesondere die Überprüfung der Wirksamkeit an geeigneten Großtiermodellen gefordert, die die Situation des menschlichen Schlaganfallpatienten möglichst realistisch wiedergeben sollen (SAVITZ et al. 2011). Eine Voraussetzung für die erfolgreiche Testung eines zelltherapeutischen Ansatzes in einem Großtiermodell mit fokaler zerebraler Ischämie besteht darin, ein langfristiges Überleben xenogener Zelltransplantate durch ein geeignetes Immunsuppressionsprotokoll zu erreichen. Die Notwendigkeit einer Immunsuppression besteht darin, dass sowohl allo- als auch xenogene Transplantate eine Immunantwort beim Empfänger auslösen und somit zu einer Abstoßungsreaktion führen können (JANEWAY 2002). Die Anwendung von immunsuppressiven Medikamenten geht dabei aber häufig mit Nebenwirkungen einher. Insbesondere beim Schaf existiert jedoch nur eine limitierte Datenlage zu immunsuppressiven Protokollen und deren Nebenwirkungen.
Ziele der Untersuchung
Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, eine xenogene Transplantation von fetalen humanen neuralen Progenitorzellen (fhNPZ) in einem gesunden Schafsmodell durchzuführen, um die Wirksamkeit in Hinblick auf das Transplantatüberleben und die Nebenwirkungen einer Immunsuppression mittels Cyclosporin A (CsA) zu untersuchen.
Materialien und Methoden
Hierfür wurden je 5 Schafe in zwei Gruppen über einen Zeitraum von 64 Tagen immunsupprimiert (iCsA: 3 mg CsA/kg 2x tägl. bis einschließlich Tag 36, danach 3 mg CsA/kg 1x tägl. jeden 3. Tag; kCsA: kontinuierlich 3 mg CsA/kg 2x tägl.), während eine Kontrollgruppe (Kon) von ebenfalls 5 Tieren keine Immunsuppression erhielt. Am Versuchstag 22 wurde den Schafen eisenmarkierte fhNPZ (Eisenkonzentration: 3,0 mM, ca. 200.000 Zellen pro Transplantationsposition) stereotaktisch in das gesunde Gehirn transplantiert. Aufgrund der Eisenmarkierung der Stammzellen konnten diese an den Versuchstagen 23, 36 und 64 mittels 3,0 MRT-Aufnahmen in vivo überwacht und anschließend ex vivo das Überleben der fhNPZ im Schafhirn 42 Tage nach Transplantation histologisch untersucht werden. Für die Untersuchungen zu Wirkspiegeln und Nebenwirkungen von CsA im Schaf wurden den Versuchstieren innerhalb des Versuchszeitraums regelmäßig Blutproben entnommen und am Versuchsende eine pathologische und histologische Untersuchung von Leber und Nieren durchgeführt.
Ergebnisse
Bei den durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass die CsA-Wirkspiegel im Blut bei der kCsA (424,0 ± 135,0 ng/ml) signifikant höher waren im Vergleich zur iCsA (198,5 ± 155,9 ng/ml). Diese Unterschiede besaßen jedoch keinen Einfluss auf das Langzeitüberleben der transplantierten fhNPZ. In keiner der drei Versuchsgruppen konnten vitale Zellen 42 Tage nach der Transplantation aufgefunden werden. Die Untersuchung der Nebenwirkungen von CsA ergab, dass die Langzeitgabe von CsA Anzeichen für einen hämatologischen Einfluss zeigt. Ebenso konnte sowohl eine hepatotoxische, als auch eine nephrotoxische Wirkung von CsA beim Schaf nachgewiesen werden.
Schlussfolgerungen
Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass die Gabe von 3 mg CsA/kg 2x tägl. nicht suffizient einer Abstoßungsreaktion xenogener ins Schafhirn transplantierter fhNPZ entgegenwirkt. Für das Ziel einer suffizienten zelltherapeutischen Anwendung im Schaf nach einem Schlaganfall sind somit weitere Untersuchungen zu einer wirksamen Immunsuppression beim Schaf und zu einem verbesserten Transplantatüberleben notwendig. Desweiteren konnten klinische und pathologische Nebenwirkungen beim Schaf durch die Langzeitgabe des Immunsuppressivums CsA festgestellt werden.:INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................................................... I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... VI
1 EINLEITUNG .............................................................................................................................. 1
2 LITERATURÜBERSICHT ......................................................................................................... 2
2.1 Klassifikation von Stammzellen ......................................................................................... 2
2.2 Tierexperimentelle Stammzelltherapie beim Schlaganfall .............................................. 5
2.2.1 Hintergrund der translationalen Forschung am Tiermodell ............................................... 5
2.2.2 Tiermodelle der fokalen zerebralen Ischämie .................................................................... 6
2.2.3 Das Schaf als Großtiermodell ............................................................................................ 7
2.2.4 Transplantation fhNPZ als zelltherapeutischer Ansatz nach fokaler zerebraler Ischämie . 8
2.2.4.1 Die In-vivo-Überwachung von in Schafhirne transplantierten fhNPZ .......................... 9
2.2.4.2 Der immunhistochemische Nachweis vitaler humaner Zellen ex vivo im Schafhirn .. 11
2.3 Immunsuppression nach der Transplantation von Stammzellen .................................. 12
2.3.1 Wirkmechanismen des angeborenen und erworbenen Immunsystems ........................... 12
2.3.2 Immunantwort nach Transplantation ............................................................................... 12
2.3.3 Wirkstoffklassen von Immunsuppressiva ........................................................................ 14
2.3.4 Cyclosporin A .................................................................................................................. 16
2.3.4.1 Wirkmechanismus von Cyclosporin A ........................................................................ 16
2.3.4.2 Pharmakokinetik und Metabolisierung von Cyclosporin A ........................................ 16
2.3.4.3 Applikation und Dosierung von Cyclosporin A .......................................................... 17
2.3.4.4 Nebenwirkungen und Toxizität von Cyclosporin A .................................................... 17
2.3.4.5 Anwendung von Cyclosporin A in der tierexperimentellen Forschung ...................... 18
2.4 Fragestellung und Versuchsziele der Dissertation .......................................................... 19
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ............................................................................... 20
3.1 Zellkultur ............................................................................................................................ 20
3.1.1 Zellkulturmedien und Zusammensetzung ........................................................................ 20
3.1.2 Auftauen und Aussaat der Zellen .................................................................................... 20
3.1.3 Ablösen der Zellen ........................................................................................................... 21
3.1.4 Zellzählung mittels Trypanblautest ................................................................................. 21
3.1.5 Passagieren der Zellen ..................................................................................................... 21
3.1.6 Eisenmarkierung der Zellen ............................................................................................. 22
3.1.7 Proliferations- und Vitalitätstests .................................................................................... 22
3.1.8 Ablösen der Zellen für Transplantationsexperimente ...................................................... 22
3.1.9 Mykoplasmentest ............................................................................................................. 23
3.2 Bestimmung der T2 NMR-Relaxationszeit ...................................................................... 23
3.3 Gelphantome ....................................................................................................................... 24
3.3.1 Herstellung und Ausgießen .............................................................................................. 24
3.3.2 Anfertigen von In-vitro-MRT-Aufnahmen zum Nachweis der eisenmarkierten fhNPZ . 25
3.4 Versuchstiere ...................................................................................................................... 26
3.4.1 Tierhaltung ....................................................................................................................... 26
3.4.2 Versuchstiere im tierexperimentellen Versuch ................................................................ 26
3.4.2.1 Tierärztliche Untersuchung der Vitalparameter .......................................................... 26
3.4.2.2 Durchführung des neurologischen Untersuchungsgangs ............................................. 27
3.4.2.3 Blutprobenentnahme, Versand und Detektiermethode ................................................ 27
3.5 Versuchsaufbau und Durchführung ................................................................................ 28
3.5.1 Anästhesie ........................................................................................................................ 29
3.5.2 Schmerzmittelregime und Infektionsprophylaxe ............................................................. 30
3.5.3 Implantation des Portsystems .......................................................................................... 31
3.5.4 Applikation von CsA ....................................................................................................... 32
3.5.4.1 Herstellung der Infusionslösung .................................................................................. 32
3.5.4.2 Applikation über das Portsystem ................................................................................. 33
3.5.5 Stammzelltransplantation ................................................................................................. 33
3.5.5.1 Anfertigen von MRT-Aufnahmen im 1,5 T MRT ....................................................... 34
3.5.5.2 Planung der stereotaktischen Zelltransplantation ........................................................ 34
3.5.5.3 Stereotaktische Zelltransplantation .............................................................................. 34
3.5.6 Nachweis der eisenmarkierten Stammzellen im 3,0 T MRT ........................................... 35
3.5.6.1 Methodik zum Nachweis und zur Quantifizierung der eisenmarkierten fhNPZ im Schafhirn ...................................................................................................................... 35
3.5.7 Sektion der Versuchstiere und Probenentnahme ............................................................. 36
3.5.8 Anfertigen der histologischen Gewebeschnitte ................................................................ 36
3.5.8.1 Herstellung der Paraffinschnitte .................................................................................. 37
3.5.8.2 Probenaufarbeitung und Lamellieren der Gehirne ....................................................... 37
3.5.8.3 Herstellung der Gefrierschnitte .................................................................................... 38
3.5.9 Histologische Färbungen ................................................................................................. 38
3.5.9.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ....................................................................................... 40
3.5.9.2 Berliner Blau-Färbung ................................................................................................. 40
3.5.9.3 Fouchét-Färbung .......................................................................................................... 40
3.5.9.4 Immunmarkierung mit STEM101-DAB und Berliner Blau-Färbung ......................... 40
3.5.9.5 Immunhistologische Markierung mit Iba1-Antikörpern .............................................. 40
3.5.10 Auswertung der histologischen Präparate ........................................................................ 41
3.6 Statistik ............................................................................................................................... 44
4 ERGEBNISSE ............................................................................................................................. 47
4.1 Nachweis eisenmarkierter fhNPZ in vitro via MRT-Aufnahmen .................................. 47
4.1.1 Welche Eisenkonzentration ist für die Markierung der fhNPZ am geeignetsten? ........... 47
4.1.2 Können markierte fhNPZ durch eine T2-gewichtete MRT-Sequenz dargestellt werden?
......................................................................................................................................... 49
4.1.3 Wo liegt das Detektionslimit markierter fhNPZ in einer T2-gewichteten MRT-Sequenz?
......................................................................................................................................... 50
4.2 Der Einfluss des Immunsuppressivums CsA auf das Überleben der transplantierten fhNPZ im Schafhirn .......................................................................................................... 51
4.2.1 Gibt es gruppenspezifische Unterschiede in den CsA-Blutkonzentrationen? ................. 51
4.2.2 Besitzt die Transplantation fhNPZ einen neurologischen Einfluss auf die Sensorik und Motorik? .......................................................................................................................... 54
4.2.3 Was geschieht mit den transplantierten fhNPZ im Zeitverlauf und Gruppenvergleich? . 55
4.2.4 Können vitale fhNPZ 42 Tage nach Transplantation im Schafhirn nachgewiesen werden?
......................................................................................................................................... 56
4.3 Klinische und pathologische Nebenwirkungen von CsA im Schaf ................................ 59
4.3.1 Beeinflusst die CsA-Applikation in vivo klinische Parameter oder Blutwerte beim Schaf?
......................................................................................................................................... 59
4.3.1.1 Auswertung der Körpertemperaturverläufe ................................................................. 59
4.3.1.2 Auswertung der Körpergewichtsverläufe .................................................................... 60
4.3.1.3 Auswertung hämodynamischer Parameter .................................................................. 61
4.3.1.4 Auswertung hämatologischer Blutparameter .............................................................. 62
4.3.1.5 Auswertung leberspezifischer Blutparameter .............................................................. 65
4.3.1.6 Auswertung nierenspezifischer Blutparameter ............................................................ 69
4.3.1.7 Auswertung sonstiger Blutparameter .......................................................................... 70
4.3.2 Können ex vivo toxische Einflüsse von CsA auf das Schaf nachgewiesen werden? ....... 71
4.3.2.1 Makroskopische Auswertung der Sektionsbefunde .................................................... 71
4.3.2.2 Histologische Auswertung Leber und Nieren ............................................................. 73
5 DISKUSSION ............................................................................................................................. 76
5.1 Hintergrund der Arbeit und Versuchsziele ..................................................................... 76
5.2 Bewertung des Studiendesigns und der Versuchsdurchführung .................................. 76
5.2.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen ........................................................................ 76
5.2.2 Studiendesign und das Schaf als Tiermodell ................................................................... 77
5.3 Diskussion der Ergebnisse ................................................................................................. 78
5.3.1 Ein Nachweis eisenmarkierter fhNPZ in vitro via MRT-Aufnahmen ist möglich .......... 78
5.3.1.1 Eine Eisenkonzentration von 3,0 mM ist für die Markierung der fhNPZ am geeignetsten ................................................................................................................. 79
5.3.1.2 Markierte fhNPZ können durch eine T2-gewichtete Sequenz dargestellt werden ...... 80
5.3.1.3 Das Detektionslimit markierter fhNPZ liegt in einer T2-gewichteten MRT-Sequenz bei 50.000 Zellen ......................................................................................................... 81
5.3.2 Die Langzeitgabe des Immunsuppressivums CsA besitzt keinen Einfluss auf das Überleben der transplantierten fhNPZ im immunprivilegierten Gehirn .......................... 81
5.3.2.1 Es gibt gruppenspezifische Unterschiede in den CsA-Blutkonzentrationen ............... 81
5.3.2.2 Die Transplantation von fhNPZ besitzt keinen bedeutenden Einfluss auf die Sensorik und Motorik ................................................................................................................. 83
5.3.2.3 Die transplantierten fhNPZ zeigen Veränderungen in Zeitverlauf und Gruppenvergleich ........................................................................................................ 84
5.3.2.4 Es können keine vitalen fhNPZ 42 Tage nach Transplantation im Schafhirn nachgewiesen werden .................................................................................................. 85
5.3.2.5 Schlussfolgerung zur Immunsuppression mittels CsA nach Stammzelltransplantation ins Schafhirn ................................................................................................................ 87
5.3.3 Die Langzeitgabe von CsA verursacht Anzeichen für pathologische Veränderungen und klinische Symptome beim Schaf ...................................................................................... 88
5.3.3.1 Die Langzeitgabe von CsA beeinflusst klinische Parameter beim Schaf .................... 88
5.3.3.2 Die Langzeitgabe von CsA zeigt wahrscheinlich keine hämodynamische Wirkung .. 89
5.3.3.3 Die Gabe von CsA zeigt Anzeichen für eine hämatologische Wirkung beim Schaf ... 89
5.3.3.4 Die Gabe von CsA zeigt eine hepatotoxische Wirkung beim Schaf ........................... 90
5.3.3.5 Die Gabe von CsA zeigt eine nephrotoxische Wirkung beim Schaf ........................... 93
5.3.3.6 Die Langzeitgabe von CsA beeinflusst weitere unspezifische Blutparameter ............ 95
5.3.3.7 Schlussfolgerungen zu Nebenwirkungen von CsA beim Schaf .................................. 95
5.4 Allgemeine Schlussfolgerung ............................................................................................. 95
5.5 Ausblick ............................................................................................................................... 96
6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................ 97
7 SUMMARY ................................................................................................................................. 99
8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................. 101
9 ANHANG ................................................................................................................................... 110
9.1 Ergänzende Tabelle zur Herstellung der Gelphantome ............................................... 110
9.2 Ergänzende Tabellen zur Herstellung histologischer Präparate ................................. 111
9.2.1 Herstellung der Paraffinblöcke ...................................................................................... 111
9.2.2 Histologische Färbungen und Immunhistochemische Methoden .................................. 112
9.3 Ergänzende Tabellen zur Statistik ................................................................................. 116
9.4 Verwendete Referenzwerte ............................................................................................. 118
9.5 Übersicht der ausgewerteten Blutparameter ................................................................ 119
9.6 Übersicht zu tierexperimentellen Einsätzen von Stammzellen in Schlaganfallmodellen
........................................................................................................................................... 122
9.7 Auflistung verwendeter Materialien und Geräte .......................................................... 123
9.8 Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................... 129
9.9 Formelverzeichnis ............................................................................................................ 130
9.10 Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 130
10 DANKSAGUNG ....................................................................................................................... 132
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:15118 |
| Date | 27 September 2016 |
| Creators | Diehl, Rita |
| Contributors | Mülling, Christoph, Boltze, Johannes, Sterner-Kock, Anja, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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