Le maintien de l'homéostasie rédox des thiols, dépendant du pouvoir réducteur du<br />NADPH, est un processus vital pour la cellule faisant intervenir deux voies supposées<br />distinctes : 1) thiorédoxine réductase/thiorédoxines et 2) glutathion<br />réductase/glutathion/glutarédoxines. En dépit de leur importance, on connaît mal la spécificité<br />des glutarédoxines et des thiorédoxines [1]. C'est particulièrement vrai chez les organismes<br />photosynthétiques, dont le métabolisme rédox, dépendant de la photosynthèse, est essentiel à<br />la biosphère (production d'oxygène, assimilation du carbone et de l'azote inorganiques<br />nécessaires à la production de biomasse pour la chaîne alimentaire). La photosynthèse,<br />comme la respiration, produit des molécules oxydantes (les espèces activées de l'oxygène) qui<br />perturbent, entre autres, l'homéostasie rédox des thiols.<br />Dans le cas des glutarédoxines, il a été montré, chez les organismes hétérotrophes, que ces<br />enzymes utilisent le pouvoir réducteur du glutathion (re-réduit par le NADPH via la<br />glutathion réductase) pour contrôler l'état rédox des thiols des résidus cystéines (Cys) des<br />protéines (réduire les ponts disulfure inter- ou intra-moléculaires). Les glutarédoxines se<br />répartissent en deux grandes familles, selon la composition de leur centre rédox actif : les<br />glutarédoxines à dithiol (possédant un site actif de type CysXXCys) et les glutarédoxines à<br />monothiol (avec un site actif de type CysXXSer).<br />Au cours de ma thèse, j'ai analysé, in vitro et in vivo, les glutarédoxines avec un organisme<br />photosynthétique modèle: la cyanobactérie unicellulaire Synechocystis PCC6803<br />(Synechocystis), qui possède un petit génome (3,57 Mb) entièrement séquencé et<br />génétiquement manipulable avec les vecteurs plasmidiques développés au laboratoire.<br />Synechocystis possède 3 glutarédoxines (Grx): deux à dithiol (Grx1 et Grx2) et une à<br />monothiol (Grx3). Dans un premier temps, j'ai inactivé les 3 gènes correspondants,<br />indépendamment ou non. Tous les mutants correspondants (simples, doubles et triple) sont<br />parfaitement viables, dans les conditions standard de croissance. Par contre, leur tolérance aux<br />stress diffère de celle de la souche sauvage. Le mutant Dgrx1 est sensible au mercure (HgCl2)<br />et à l'uranium ((CH3COO)2UO2). Le mutant Dgrx2 est sensible au peroxyde d'hydrogène<br />(H2O2), au cadmium (CdSO4) et au sélénate (NaSeO4). Le mutant Dgrx3 est sensible au bleu<br />de méthylène. Le triple mutant Dgrx1Dgrx2Dgrx3 est sensible à chacun des toxiques<br />précédemment cités, et aussi, de façon spécifique par rapport aux autres mutants, à un excès<br />(x25) de zinc (ZnCl2). Ces résultats indiquent que les Grx possèdent une certaine sélectivité,<br />qui s'exerce vraisemblablement au travers d'interactions spécifiques.<br />11<br />Pour rechercher des partenaires protéiques des Grx, j'ai utilisé un système bactérien de<br />"double hybride", basé sur 2 plasmides dans lesquels on peut cloner, indépendamment, les<br />gènes codant pour les protéines "appâts" (chacun des trois gènes grx) et les protéines "proies"<br />(les partenaires possibles des Grxs). Pour identifier ces dernières, nous avons cloné,<br />indépendamment, une cinquantaine des gènes impliqués dans métabolisme rédox, sans se<br />limiter au contrôle de l'homéostasie rédox des thiols. Les 1000 tests d'interaction réalisés<br />nous ont permis d'identifier 10 interactions totalement nouvelles impliquant des Grx. Ensuite,<br />j'ai analysé les interactions (1) Grx1-MerA (MerA est la réductase du mercure) et (2)<br />thiorédoxine réductase-Grx1-Grx2, par une approche multidisciplinaire: (i) mutagenèses<br />dirigées, tests double hybride et études in vivo; (ii) approche biochimique (GST Pulldown); et<br />(iii) tests d'activité in vitro.<br />J'ai montré que l'activité de réduction du mercure de MerA est inhibée, de façon réversible,<br />par la glutathionylation (fixation d'une molécule de glutathion) d'une cystéine (Cys78) de son<br />site actif. Grx1 réactive MerA en catalysant la réaction de déglutathionylation du site actif de<br />MerA. Outre la tolérance de Synechocystis au mercure (HgCl2), j'ai montré que Grx1 et MerA<br />interviennent également dans la résistance à l'uranium (CH3COO)2UO2.<br />Parallèlement, j'ai analysé les interactions thiorédoxine réductase-Grx1-Grx2. J'ai montré que<br />la thiorédoxine réductase est capable de réduire Grx1, qui peut à son tour réduire Grx2. Cette<br />voie rédox originale compense l'absence de glutathion réductase chez Synechocystis. J'ai<br />également montré que cette "nouvelle" voie rédox est capable de réduire le sélénate. Ces<br />résultats in vitro sont confortés par certains de mes résultats qui suggèrent que Synechocystis<br />répond au sélénate par la formation d'un hétérodimère Grx1-Grx2.<br />Les deux "nouvelles" voies rédox caractérisées au cours de ma thèse sont particulièrement<br />intéressantes car elles permettent de relier deux processus rédox, homéostasie rédox des thiols<br />et détoxication des métaux lourds par réduction, qui n'étaient jusqu'ici pas considérés comme<br />étant étroitement imbriqués.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00104387 |
| Date | 16 March 2005 |
| Creators | Marteyn, Benoit |
| Publisher | Université Paris Sud - Paris XI |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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