Infecções pelos Papilomavirus Humanos (HPVs) estão relacionadas com uma série de malignidades nas regiões genitais, anais e recentemente a uma parcela dos tumores na região da cabeça e pescoço. Enquanto muito já fora explorado a respeito dessas infecções em mulheres, os fatores de risco virais e epidemiológicos para persistência da infecção e desenvolvimento de lesão em homens ainda estão sendo estabelecidos. Dessa forma, em meados de 2005, começou o Estudo HIM (HPV in men), um estudo multicêntrico envolvendo 4200 homens que tem como principal objetivo um melhor entendimento da história natural das infecções por esses vírus nessa população. Sabe-se que um importante evento no processo neoplásico em lesões do colo do útero é a integração do DNA viral no genoma da célula hospedeira. Embora o mecanismo de integração ainda não esteja claro, parece haver uma relação da progressão da doença com o aumento da proporção de lesões com genomas na forma integrada. Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi explorar as metodologias baseadas em PCR (convencional e em tempo real) e de sequenciamento de última geração (NGS) para verificar integração do DNA viral nas células de esfregaços genitais, do canal anal e cavidade oral de homens assintomáticos participantes do Estudo HIM. Além disso, teve como objetivo secundário verificar a carga viral nos diferentes sítios anatômicos. Foram inicialmente incluídas 125 amostras das quais 56 puderam ser incluídas nas análises de integração pela metodologia baseada em PCR e 90 amostras foram selecionadas para os ensaios de carga viral. Dentre as amostras testadas pela metodologia de PCR para integração, 11 foram desafiadas pela metodologia baseada em sequenciamento. Entre as 11 amostras sequenciadas, encontramos concordância entre os resultados em apenas 3 e isso pode ser atribuído à sensibilidade diferencial das metodologias diante de baixas cargas virais. Entre as amostras testadas pela metodologia baseada em PCR pudemos verificar que 30,4% das amostras apresentavam-se na forma puramente epissomal, 10,7% na forma puramente integrada e 58,9% das amostras apresentam as duas formas virais (classificadas como mistas). A amostra que se confirmou integrada pela metodologia de sequenciamento apresentou integração em 4 pontos do DNA humano com a ruptura no gene viral E2, conforme amplamente relatado na literatura. Grande variação na carga viral foi encontrada entre as amostras (0,00008 a 4200 cópias/célula), e isso se mostrou diretamente relacionado com as limitações das metodologias para verificar integração. Embora outras relações não puderam ser verificadas em nosso estudo pelo limitado número de amostras analisadas até o momento, estes dados ampliados poderão responder se a carga viral e integração seriam um fator de risco para a persistência da infecção ou o desenvolvimento de lesão em homens. / Human Papillomavirus (HPV) infections are associated with a range of malignancies in the genital and anal regions and recently, with an appreciable number of head and neck tumors. While much has been explored about these infections in women, viral and epidemiological risk factors for persistent infection and lesions development in men are still being established. Thus, in mid-2005, a multicenter study entitled HIM study (HPV in men) - involving 4200 men - which aims at a better understanding of the natural history of infection by these viruses in this population, was started. It is known that a key event in the transformation process in cervical lesions is the integration of viral DNA into the host cell genome. Although the integration mechanism is not yet clear, there seems to be a relationship of the disease progression with an increase of the proportion of lesions with integrated viral genomes. In view of the above, the aim of this study was to explore the methodologies based on PCR (conventional and real-time) and next-generation sequencing (NGS) to verify integration of viral DNA into cells from genital swabs, anal canal and oral cavity of asymptomatic men participating in the HIM study. Furthermore, the secondary objective was to verify the viral load in cells from different anatomical sites. Initially, 125 samples were selected of which 56 could be included in integration tests with the methodology based on PCR and 90 samples were selected for viral load determination. Of the samples tested by PCR method for integration, 11 were subjected DNA sequencing. We found correlation between the results in only 3 of the 11 samples and this can be attributed to the methodologies\' differential sensitivity to low viral loads. Among the samples tested by PCR-based methodology, we observed that 30.4% of the samples harbored purely episomal viral DNA, 10.7% were integrated and 58.9% of the samples showed the two viral forms (classified as mixed). The sample which was confirmed as integrated by sequencing presented integration into 4 human DNA points with the breakpoint within the E2 viral gene, as widely reported in literature. Large variation in viral load was observed among the samples (0.00008 to 4200 copies / cell), and this was shown to be directly related to the limitations of the methods used to verify integration. Evaluation of a larger number of samples may contribute to define the role of HPV DNA integration as a risk factor for the persistence of HPV infection or development of lesions in men.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-30112016-105211 |
| Date | 04 November 2016 |
| Creators | Ricardo Cesar Cintra |
| Contributors | Luisa Lina Villa, Sérgio Mancini Nicolau, Eduardo Moraes Rego Reis |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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