Η λυοφιλοποίηση θεωρείται ιδανική μέθοδος για βραχύχρονη ή/ και μακρόχρονη αποθήκευση λιποσωμάτων. Στόχος αυτής της μελέτης ήταν να ευρεθούν οι ποσότητες κρυοπροστατευτικού που μπορεί να αυξήσουν τη συγκράτηση πρωτεϊνικών μορίων σε λιποσώματα τα οποία είναι ασταθή (δηλ. χάνουν μεγάλο τμήμα της εγκλωβισμένης πρωτεΐνης) μετά από λυοφιλοποίηση. Η μέθοδος παρασκευής των λιποσωμάτων που χρησιμοποιήθηκε ήταν η DRV μέθοδος. Είναι η πλέον κατάλληλη στην περίπτωση εγκλωβισμού πρωτεϊνικών μορίων καθώς επιτυγχάνει υψηλά ποσοστά εγκλωβισμού και επίσης χρησιμοποιεί ήπιες συνθήκες οπότε προστατεύεται η τριτοταγής δομή των πρωτεϊνών. Η διαδικασία βασίζεται στην αφυδάτωση μίγματος “άδειων” SUV (μικρών μονοστοιβαδιακών) λιποσωμάτων παρουσία του διαλύματος πρωτεΐνης που πρόκειται να εγκλωβιστεί. Μετά από ελεγχόμενη επανενυδάτωση της ξηρής κόνης σχηματίζονται τα DRV λιποσώματα. (από τις λέξεις dried-rehydrated vesicles που μεταφράζονται ως αφυδατωμένα-επανενυδατωμένα σωματίδια).
Ως υλικά για την παρασκευή των λιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα εξής: Φωσφατιδυλοχολίνη αυγού (egg PC), διστεαροϋλο-γλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC), διπαλμιτοϋλο-γλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DPPC), διμυριστοϋλο-γλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DΜPC), φωσφατιδυλογλυκερόλη (PG) και χοληστερόλη (CHOL).
Παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο DRV λιποσώματα διαφόρων λιποσωμικών συστάσεων προκειμένου να μελετηθεί η ικανότητα εγκλωβισμού για κάθε λιποσωμική σύσταση και να επιλεγούν αυτές που είναι πλέον ασταθείς για περαιτέρω μελέτη. Ως πρωτεΐνη μοντέλο χρησιμοποιήθηκε η αλβουμίνη βόειου ορού (BSA).
Μελετήθηκε η επίδραση της λυοφιλοποίησης σε διάφορα DRV λιποσώματα παρουσία ή/ και απουσία κρυοπροστατευτικού παράγοντα (τρεαλόζη). Σε κάποιες περιπτώσεις προστέθηκε τρεαλόζη εντός των λιποσωμάτων κατά την αρχική παρασκευή των DRV (στο στάδιο της ανασύστασης).
Επίσης, προκειμένου να αποκτήσουμε περαιτέρω πληροφορίες για τα λιποσώματα που μελετούσαμε, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός του μεγέθους των ορισμένων λιποσωμικών σειρών και μορφολογική μελέτη με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης.
Στη συνέχεια, με βάση τα αρχικά αποτελέσματα με την αλβουμίνη, επιλέχθηκαν ορισμένες λιποσωμικές συστάσεις προκειμένου να μελετηθεί η σταθερότητα λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν ένα βιοδραστικό μόριο, το t-PA (ιστικού τύπου ενεργοποιητή πλασμινογόνου) σε ξηρή μορφή. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με δείκτη τη διατήρηση της ενεργότητας του μορίου μετά από FD και προσθήκη ή όχι τρεαλόζης.
Απώτερος σκοπός αυτής της εργασίας είναι η δυνατότητα παρασκευής σταθερών t-PA- λιποσωμικών μορφών σε ξηρή μορφή προκειμένου να μελετηθεί η δράση τους στη θεραπεία θρομβώσεων του αμφιβληστροειδούς.
Τα βασικά συμπεράσματα της μελέτης είναι τα εξής:
Σχετικά με αποτελέσματα πειραμάτων με BSA:
* Τα PC:PG:CHOL DRV λιποσώματα σταθεροποιούνται ικανοποιητικά αν πριν τη λυοφιλοποίηση προσθέσουμε αναλογία treh/lipid=5/1 στη λιποσωμική διασπορά.
* Η καλύτερη σταθεροποίηση επιτυγχάνεται με παρουσία σακχάρου στο εσωτερικό και εξωτερικό των λιποσωμάτων
* Πιθανή αλληλεπίδραση λαμβάνει χώρα μεταξύ των PC λιποσωμάτων και της αλβουμίνης, δίνοντας ψευδή υψηλά τελικά ποσοστά συγκράτησης μετά τη λυοφιλοποίηση
Σχετικά με αποτελέσματα πειραμάτων με t-PA
* Τα αποτελούμενα από DSPC DRV λιποσώματα παραμένουν πολύ σταθερά διατηρώντας την ενεργότητα του t-PA μετά τη λυοφιλοποίηση και χωρίς την προσθήκη κρυοπροστατευτικού.
* Τα ασταθή PC:PG:CHOL και PC λιποσώματα σταθεροποιούνται ικανοποιητικά με προσθήκη τρεαλόζης πριν το FD. / Lyophilization is considered to be an ideal technique for both short-term and long-term storage of liposomes. The objective of this study was to investigate the stability of liposomes encapsulating protein molecules and the effect of freeze-drying (FD) on the stability of dehydrated-rehydrated vesicles (DRV) with and without cryoprotective agents (CPA). Τhe liposomes were prepared by the DRV method. This is considered to be the most appropriate in the cases that entrapment of proteins is desired, since it gives liposomes with high encapsulation efficiencies and by using mild conditions it protects the tertiary structure of proteins retaining thus their biological activity. The procedure followed here was based on dehydration of a mixture of “empty” SUV liposomes and the protein solution (BSA) which is to be entrapped, followed by controlled rehydration of the dry powder.
The materials used for the preparation of the liposomes were:
Egg-PC (phosphatidylcholine), distearoyloglycerophosphatidylcholine(DSPC), (DPPC) dipalmitoylglycerophosphatidylcholine, (DΜPC) dimyristoylglycerophosphatidylcholine, PG (phosphatidylglycerol) and CHOL (cholesterol).
Liposomes of various lipid compositions were prepared so that the most unstable liposome compositions are found and available for further study. BSA was used as a protein model in these experiments.
Furthermore, the influence of lyophilization for liposomes of various compositions was studied using trehalose as a cryoprotective agent. In some experiments, the dissacharide was added during the reconstitution of DRV.
In order to have some more information about the liposomes under investigation, we conducted particle size determination (zetasizer) and morphological study by SEM (scanning electron microscopy.
Eventually, based on the primary results with albumin, the stability of liposomes bearing a bioactive protein was studied. The protein used here was t-PA (tissue type plasminogen activator). We investigated the influence of FD on the stability of liposomes with or without the addition of a cryoprotective agent (trehalose) as a function of bioactivity retention.
A long-term objective of our studies is to prepare stable after FD liposomal- tPA-formulations that may be active for therapy of ocular thrombosis cases.
The mail conclusions of this study were:
Concerning the results obtained with BSA:
* PC:PG:CHOL DRV liposomes are adequately stabilized when trehalose in mass ratio treh/PC=5/1 is added in the liposomal dispersion
* Maximum retention of BSA is achieved when trehalose is added on both sides of liposomal membrane.
* There is a possible interaction between BSA and PC liposomes, which results in false estimation of BSA retention after FD.
Concerning the results obtained with t-PA:
* DSPC DRV liposomes are very stable after FD and they preserve t-PA activity even in absence of cryoprotectant.
* Unstable PC:PG:CHOL and PC liposomes can be adequately stabilized by trehalose.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/1332 |
| Date | 11 February 2009 |
| Creators | Ντυμένου, Βασιλική Π. |
| Contributors | Αντιμησιάρη, Σοφία, Αντιμησιάρη, Σοφία, Αυγουστάκης, Κωνσταντίνος, Κλεπετσάνης, Παύλος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0031 seconds