Micoplasmas estão difundidos pela natureza e são caracterizados por um genoma relativamente pequeno, baixo conteúdo GC e ausência de parede celular e de algumas rotas biossintéticas. Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, capaz de colonizar o trato respiratório e seu crescimento in vitro, comparado com o de outros micoplasmas, é mais lento. Mycoplasma hyorhinis também é encontrado no trato respiratório de suínos. Devido à falta de algumas vias biossintéticas, micoplasmas são incapazes de sintetizar alguns nutrientes e componentes essenciais, sendo forçados a obtê-los do ambiente. Assim, um dos maiores empecilhos enfrentados na pesquisa e diagnóstico de micoplasma tem sido a dificuldade do cultivo in vitro. Portanto, o desenvolvimento de um meio de composição definida que sustente o crescimento celular serviria como uma ferramenta controladamente manipulável, permitindo a definição de suas vias metabólicas assim como análises genéticas. O objetivo do presente estudo foi analisar a viabilidade, taxa de crescimento e regulação gênica de M. hyopneumoniae e M. hyorhinis em diferentes meios de cultivo, assim como em diferentes condições de cultura. Neste trabalho, foi utilizado o meio Friis (1975) como meio complexo, e quatro meios definidos: (i) meio descrito para Mycoplasma pneumoniae por Yus et al. (2009); (ii) meio Yus sem adição de peptona; (iii) meio comercial CMRL e (iv) meio CMRL+ (complementado com lipídeos, aminoácidos e vitaminas). A viabilidade celular foi avaliada em todos os meios definidos e a taxa de crescimento de ambas as espécies nos cinco meios foi avaliada por citometria de fluxo. Os resultados demonstraram que a composição do meio influencia no crescimento da bactéria, uma vez que há diferença entre a concentração celular em cada meio testado. Entretanto, ambas as espécies apresentaram concentração celular semelhante em cada meio. Os resultados demonstram que, dentre os meios definidos testados, o meio CMRL+, desenvolvido no presente estudo, é o meio mais adequado, podendo ser considerado um meio de manutenção para estes microrganismos. Para a avaliação da regulação gênica através de qPCR, M. hyopneumoniae foi cultivado em meio Friis e CMRL+ sendo posteriormente submetido a condições de estresse (choque térmico e estresse oxidativo). Os resultados obtidos sugerem que M. hyopneumoniae altera seus níveis transcricionais mais rapidamente quando cultivado em meio CMRL+, provavelmente devido ao estresse duplo causado pela privação nutricional e estresse oxidativo ou choque térmico. Na condição de choque térmico, o tipo de regulação predominante diferiu entre os dois meios, enquanto que, quando submetido a estresse oxidativo, os genes apresentaram um padrão de regulação semelhante entre Friis e CMRL+. O meio de cultivo definido CMRL+ forneceu uma taxa de crescimento semelhante à do meio complexo Friis, e demonstrou presença de regulação gênica em M. hyopneumoniae em resposta à sua composição e às condições de estresse testadas. Portanto, este meio pode ser usado como uma ferramenta para o avanço da pesquisa com Mycoplasma. / Mycoplasmas are widespread in nature, and are characterized by a relative small genome, low GC content, absence of cell wall and lack of some biosynthetic pathways. Mycoplasma hyopneumoniae is the infective agent of enzootic pneumonia in swine, able to colonize the respiratory tract. Its growth is slower than other porcine mycoplasmas. Mycoplasma hyorhinis f y y . Ty y, ’ f mycoplasma that grows in culture, and its presence can frequently prevent the isolation of other Mycoplasma spp. Due to the lack of some biosynthetic pathways, mycoplasmas are incapable of synthesize some nutrients and essential compounds, being forced to obtain from the environment. Therefore, the major impediment to Mycoplasma research and laboratory diagnosis has been the difficulty of in vitro cultivation. Thus, the development of a defined medium that support mycoplasma growth would provide a tool that can be controllably manipulated to enable the definition of mycoplasmal metabolic pathways as well as genetic analysis. The aim of this work was to analyze viability, growth rate and gene regulation of M. hyopneumoniae and M. hyorhinis in different culture media, and cultivation conditions. In this work, we used Friss broth (1975) as a complex medium, and four different defined media: (i) a medium described for M. pneumoniae by Yus et al. (2009), (ii) defined Yus medium without peptone, (iii) commercial medium CMRL and (iv) CMRL+ medium (supplemented with lipids, amino acids and vitamins). All the defined media were tested towards cell viability and the growth rate of both species in the five media was assessed, through flow cytometry assay comparing between them. The results from flow cytometry assay showed that the composition of the media influences the bacterial growth, once cell concentration in each of the tested media was different. However, both species presented similar cell concentration in each media. The results demonstrate that, amongst the defined media tested, CMRL+ broth, developed in this study, b , g ’ y b . To gene regulation assessment, M. hyopneumoniae was cultivated in Friis and CMRL+ and underwent two stress conditions (heat shock and oxidative stress). Results suggest that M. hyopneumoniae alters the transcriptional levels of some genes more promptly when cultivated in CMRL+ broth, probably due to the dual stress caused by the combination of nutrients deprivation in CMRL+ broth plus heat shock or oxidative stress. In the heat shock condition, the prevailing kind of regulation differed between the two media, while when submitted to oxidative stress, genes presented similar pattern of regulation between Friis and CMRL+. CMRL+ medium provided a growth rate resembling the complex broth and M. hyopneumoniae showed to have gene expression regulation in response to its composition and to the culture conditions tested. Thus, it can be used as a tool that can be controllably manipulated enabling the definition of mycoplasmal nutritional requirements and metabolic pathways as well as genetic analysis, such as gene regulation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.lume.ufrgs.br:10183/187225 |
| Date | January 2017 |
| Creators | Beier, Laura Scherer |
| Contributors | Schrank, Irene Silveira, Maboni, Franciele |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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