O câncer gástrico já foi descrito associado com Helicobacter pylori e Mycoplasma hyorhnis. Em vista disso, este trabalho avaliou a presença de Mollicutes, M. hyorhinis e H. pylori e suas correlações com câncer gástrico. Foram obtidas 120 amostras de biopsias gástricas embebidas em parafina em Vitória da Conquista - BA, armazenadas no período de 2006-2016. Destes 80 eram de pacientes com câncer gástrico. Para a extração de DNA foi utilizado um kit comercial com desparafinização prévia. A PCR convencional foi aplicada para detecção de Mollicutes, H. pylori e M. hyorhinis, que também foi detectado por qPCR e imuno-histoquímica. Os dados obtidos foram avaliados pelos testes estatísticos de Pearson (X2) e de Mann-Whitney (p 0,05). O grupo controle apresentou maior frequência de Mollicutes (12,3%) e M. hyorhinis (11,0%). H. pylori foi detectado no grupo caso (8,2%) e mas teve maior frequência no grupo controle (22,5%). Não houve coinfecção de Mollicutes, M. hyorhinis e H. pylori no grupo caso, mas o grupo controle apresentou maior prevalência de H. pylori, com associação estatisticamente significativa (p < 0,001). Estes resultados podem direcionar para um aprimoramento de controle e conhecimento de micoplasmas e sua relevância em fenótipos malignos. / Gastric cancer has already been described associated with Helicobacter pylori and Mycoplasma hyorhnis. In view of this, this study evaluated the presence of Mollicutes, M. hyorhinis e H. pylori and its correlations with gastric cancer. 120 samples of gastric biopsies embedded in paraffin were obtained in Vitória da Conquista - BA, stored in the 2006-2016. Of these, 80 were patients with gastric cancer. For DNA extraction a commercial kit with prior dewaxing was used. Conventional PCR was applied for detection of Mollicutes, H. pylori and M. hyorhinis, it which was also detected by qPCR and immunohistochemistry. The data were evaluated by the Pearson (X2) and Mann-Whitney statistical tests (p 0,05). The control group had a higher frequency of Mollicutes (12,3%) and M. hyorhinis (11,0%). H. pylori was detected in the case group (8,2%), but had a higher frequency in the control group (22,5%). There was no coinfection of Mollicutes, M. hyorhinis and H. pylori in the case group, but the control group had a higher prevalence of H. pylori, with a statistically significant association (p < 0,001). These results may lead to improved control and knowledge of mycoplasmas and their relevance to malignant phenotypes.

As doenças respiratórias são responsáveis, na suinocultura, por grandes perdas econômicas e entre os agentes destacam-se os micoplasmas. Foram coletadas 126 amostras de muco nasal/tonsilar, e fragmentos de 78 pulmões, 2 de traquéia e 2 de tonsila. No isolamento foi utilizado o meio FRIIS modificado, na identificação, a Multiplex-PCR e na tipificação, a PFGE e sequenciamento do gene 16S rRNA. Foram obtidos 59 isolados identificados como M. hyopneumoniae (1,70%), M. flocculare (3,40%) e M. hyorhinis (94,90%). A PFGE dos isolados de M. hyorhinis, resultou em 10 e 9 perfis com a enzima AvaI e XhoI, respectivamente. O sequenciamento do gene 16S rRNA dos isolados M. hyorhinis apresentaram baixo polimorfismo quando comparados entre si e com a cepa de referência. A sequência do gene 16S rRNA do isolado de M. hyopneumoniae, quando comparada a seqüência da cepa J e os isolados 7448 e 232, resultaram em polimorfismo. O M. hyopneumoniae continua sendo o mais difícil de isolar. Os dendrogramas obtidos da PFGE resultaram em grande heterogeneidade entre os isolados de M. hyorhinis. O seqüenciamento do gene 16S rRNA permitiu o estudo de variabilidade interespecífica e intraespecífica dos isolados de micoplasmas. / Economic losses in swine production are common due the respiratory diseases in these animals. M. hyopneumoniae and M. hyorhinis are the most frequent microbial agents. The aim of this study was recover this isolates in FRIIS medium, indentify them by Multiplex PCR and detect their genotypic variations by PFGE and sequencing the 16s rRNA gene. One hundred twenty six swabs from tonsil and nasal mucus of swine with respiratory disturbances were analyzed. It was included 78 lungs, two trachea and two tonsils. It was obtained 59 isolates; 1.70% of M. hyopneumoniae, 3.40% of M. flocculare and 94.90% of M. hyorhinis. The PFGE of M. hyorhinis, allowed obtain 10 profiles with enzyme AvaI and nine profiles with XhoI. A low polymorphism of gene 16sRNS was detected in M. hyorhinis isolates when compared with the type strain at the GenBank. The M. hyopneumoniae isolates resulted in polymorphisms when comparated with strain J, 7448 and 232. M. hyopneumoniae is still the most difficult to isolate. M. hyorhinis isolates of different herds showed a large heterogenicity with enzymes AvaI e XhoI. The sequencing of gene 16S rRNA allowed analyse the interespecífic and intraespecífic variations of mycoplasmas isolated.

As doenças respiratórias são responsáveis, na suinocultura, por grandes perdas econômicas e entre os agentes destacam-se os micoplasmas. Foram coletadas 126 amostras de muco nasal/tonsilar, e fragmentos de 78 pulmões, 2 de traquéia e 2 de tonsila. No isolamento foi utilizado o meio FRIIS modificado, na identificação, a Multiplex-PCR e na tipificação, a PFGE e sequenciamento do gene 16S rRNA. Foram obtidos 59 isolados identificados como M. hyopneumoniae (1,70%), M. flocculare (3,40%) e M. hyorhinis (94,90%). A PFGE dos isolados de M. hyorhinis, resultou em 10 e 9 perfis com a enzima AvaI e XhoI, respectivamente. O sequenciamento do gene 16S rRNA dos isolados M. hyorhinis apresentaram baixo polimorfismo quando comparados entre si e com a cepa de referência. A sequência do gene 16S rRNA do isolado de M. hyopneumoniae, quando comparada a seqüência da cepa J e os isolados 7448 e 232, resultaram em polimorfismo. O M. hyopneumoniae continua sendo o mais difícil de isolar. Os dendrogramas obtidos da PFGE resultaram em grande heterogeneidade entre os isolados de M. hyorhinis. O seqüenciamento do gene 16S rRNA permitiu o estudo de variabilidade interespecífica e intraespecífica dos isolados de micoplasmas. / Economic losses in swine production are common due the respiratory diseases in these animals. M. hyopneumoniae and M. hyorhinis are the most frequent microbial agents. The aim of this study was recover this isolates in FRIIS medium, indentify them by Multiplex PCR and detect their genotypic variations by PFGE and sequencing the 16s rRNA gene. One hundred twenty six swabs from tonsil and nasal mucus of swine with respiratory disturbances were analyzed. It was included 78 lungs, two trachea and two tonsils. It was obtained 59 isolates; 1.70% of M. hyopneumoniae, 3.40% of M. flocculare and 94.90% of M. hyorhinis. The PFGE of M. hyorhinis, allowed obtain 10 profiles with enzyme AvaI and nine profiles with XhoI. A low polymorphism of gene 16sRNS was detected in M. hyorhinis isolates when compared with the type strain at the GenBank. The M. hyopneumoniae isolates resulted in polymorphisms when comparated with strain J, 7448 and 232. M. hyopneumoniae is still the most difficult to isolate. M. hyorhinis isolates of different herds showed a large heterogenicity with enzymes AvaI e XhoI. The sequencing of gene 16S rRNA allowed analyse the interespecífic and intraespecífic variations of mycoplasmas isolated.

Micoplasmas estão difundidos pela natureza e são caracterizados por um genoma relativamente pequeno, baixo conteúdo GC e ausência de parede celular e de algumas rotas biossintéticas. Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, capaz de colonizar o trato respiratório e seu crescimento in vitro, comparado com o de outros micoplasmas, é mais lento. Mycoplasma hyorhinis também é encontrado no trato respiratório de suínos. Devido à falta de algumas vias biossintéticas, micoplasmas são incapazes de sintetizar alguns nutrientes e componentes essenciais, sendo forçados a obtê-los do ambiente. Assim, um dos maiores empecilhos enfrentados na pesquisa e diagnóstico de micoplasma tem sido a dificuldade do cultivo in vitro. Portanto, o desenvolvimento de um meio de composição definida que sustente o crescimento celular serviria como uma ferramenta controladamente manipulável, permitindo a definição de suas vias metabólicas assim como análises genéticas. O objetivo do presente estudo foi analisar a viabilidade, taxa de crescimento e regulação gênica de M. hyopneumoniae e M. hyorhinis em diferentes meios de cultivo, assim como em diferentes condições de cultura. Neste trabalho, foi utilizado o meio Friis (1975) como meio complexo, e quatro meios definidos: (i) meio descrito para Mycoplasma pneumoniae por Yus et al. (2009); (ii) meio Yus sem adição de peptona; (iii) meio comercial CMRL e (iv) meio CMRL+ (complementado com lipídeos, aminoácidos e vitaminas). A viabilidade celular foi avaliada em todos os meios definidos e a taxa de crescimento de ambas as espécies nos cinco meios foi avaliada por citometria de fluxo. Os resultados demonstraram que a composição do meio influencia no crescimento da bactéria, uma vez que há diferença entre a concentração celular em cada meio testado. Entretanto, ambas as espécies apresentaram concentração celular semelhante em cada meio. Os resultados demonstram que, dentre os meios definidos testados, o meio CMRL+, desenvolvido no presente estudo, é o meio mais adequado, podendo ser considerado um meio de manutenção para estes microrganismos. Para a avaliação da regulação gênica através de qPCR, M. hyopneumoniae foi cultivado em meio Friis e CMRL+ sendo posteriormente submetido a condições de estresse (choque térmico e estresse oxidativo). Os resultados obtidos sugerem que M. hyopneumoniae altera seus níveis transcricionais mais rapidamente quando cultivado em meio CMRL+, provavelmente devido ao estresse duplo causado pela privação nutricional e estresse oxidativo ou choque térmico. Na condição de choque térmico, o tipo de regulação predominante diferiu entre os dois meios, enquanto que, quando submetido a estresse oxidativo, os genes apresentaram um padrão de regulação semelhante entre Friis e CMRL+. O meio de cultivo definido CMRL+ forneceu uma taxa de crescimento semelhante à do meio complexo Friis, e demonstrou presença de regulação gênica em M. hyopneumoniae em resposta à sua composição e às condições de estresse testadas. Portanto, este meio pode ser usado como uma ferramenta para o avanço da pesquisa com Mycoplasma. / Mycoplasmas are widespread in nature, and are characterized by a relative small genome, low GC content, absence of cell wall and lack of some biosynthetic pathways. Mycoplasma hyopneumoniae is the infective agent of enzootic pneumonia in swine, able to colonize the respiratory tract. Its growth is slower than other porcine mycoplasmas. Mycoplasma hyorhinis f y y . Ty y, ’ f mycoplasma that grows in culture, and its presence can frequently prevent the isolation of other Mycoplasma spp. Due to the lack of some biosynthetic pathways, mycoplasmas are incapable of synthesize some nutrients and essential compounds, being forced to obtain from the environment. Therefore, the major impediment to Mycoplasma research and laboratory diagnosis has been the difficulty of in vitro cultivation. Thus, the development of a defined medium that support mycoplasma growth would provide a tool that can be controllably manipulated to enable the definition of mycoplasmal metabolic pathways as well as genetic analysis. The aim of this work was to analyze viability, growth rate and gene regulation of M. hyopneumoniae and M. hyorhinis in different culture media, and cultivation conditions. In this work, we used Friss broth (1975) as a complex medium, and four different defined media: (i) a medium described for M. pneumoniae by Yus et al. (2009), (ii) defined Yus medium without peptone, (iii) commercial medium CMRL and (iv) CMRL+ medium (supplemented with lipids, amino acids and vitamins). All the defined media were tested towards cell viability and the growth rate of both species in the five media was assessed, through flow cytometry assay comparing between them. The results from flow cytometry assay showed that the composition of the media influences the bacterial growth, once cell concentration in each of the tested media was different. However, both species presented similar cell concentration in each media. The results demonstrate that, amongst the defined media tested, CMRL+ broth, developed in this study, b , g ’ y b . To gene regulation assessment, M. hyopneumoniae was cultivated in Friis and CMRL+ and underwent two stress conditions (heat shock and oxidative stress). Results suggest that M. hyopneumoniae alters the transcriptional levels of some genes more promptly when cultivated in CMRL+ broth, probably due to the dual stress caused by the combination of nutrients deprivation in CMRL+ broth plus heat shock or oxidative stress. In the heat shock condition, the prevailing kind of regulation differed between the two media, while when submitted to oxidative stress, genes presented similar pattern of regulation between Friis and CMRL+. CMRL+ medium provided a growth rate resembling the complex broth and M. hyopneumoniae showed to have gene expression regulation in response to its composition and to the culture conditions tested. Thus, it can be used as a tool that can be controllably manipulated enabling the definition of mycoplasmal nutritional requirements and metabolic pathways as well as genetic analysis, such as gene regulation.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-18T09:46:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 926264 bytes, checksum: 416b10a79cd9725bb4a42f91379a81ee (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-18T09:46:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 926264 bytes, checksum: 416b10a79cd9725bb4a42f91379a81ee (MD5) Previous issue date: 2015-08-14 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio / As duas espécies de Mycoplasma mais prevalentes na indústria suinícola são Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma hyorhinis. Estes patógenos podem causar perdas econômicas significativas para os produtores e para a indústria. Variabilidade genética tem sido observada em cepas de M. hyopneumoniae usando diferentes técnicas de tipificação. Já a diversidade genética de M. hyorhinis tem sido o foco de um número limitado de estudos nos últimos anos. Mycoplasma apresentam numerosas regiões repetitivas (VNTR) no seu genoma, e essas regiões repetitivas são conhecidos por serem sítios ativos para recombinação genética. Isso trouxe em evidencia a hipótese de que a análise em multilocus de repetições em Tandem de número variável (MLVA) seria uma técnica adequada para investigar a variação genética em Mycoplasma. Portanto, o objetivo principal desta dissertação foi investigar a distribuição não aleatória dos genótipos de diferentes localizações geográfica usando análise em multilocus de repetições em Tandem de número variável (MLVA) para tipificar M. hyopneumoniae e M. hyorhinis avançando o conhecimento sobre a diversidade genética e epidemiologia desses agentes. Quando o foco foi o estudo da diversidade genética de M. hyopneumoniae, um elevado número de tipos de MLVA parecem circular entre rebanhos de suínos com uma distribuição não aleatória dos tipos de MLVA entre regiões. Um único tipo comum não foi identificado entre as amostras obtidas a partir de todas as regiões em estudo. Do mesmo modo, foi observada a diversidade genética de M. hyorhinis, com uma variação limitada em um dos VNTRs alvo. Um ponto relevante observado neste estudo foi a identificação de diferentes tipos de MLVA no mesmo animal em diferentes tipos de amostras, o que sugere que o animal foi colonizado por diferentes cepas. Com foco na indústria de suínos do Brasil, uma das mais importantes do mundo, um estudo específico observou uma elevada diversidade de cepas de M. hyopneumoniae em circulação no país. A comparação entre o número de repetições em tandem (TR) no P97 RR1 e RR3 P146 mostrou uma correlação negativa significativa o que pode sugerir um possível mecanismo compensatório que permitiria a bactéria manter sua capacidade de aderência completa mesmo após a redução da TR em RR1-P97. Em conclusão, a identificação da heterogeneidade genética de M. hyopneumoniae e M. hyorhinis ajudará investigações epidemiológicas ou de surtos locais e ajudará conceber estratégias de controle futuras, bem como servir como uma ferramenta potencial para o estudo da biologia evolutiva da espécie. / The two most prevalent Mycoplasmas species present in the swine industry are Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis. These pathogens can cause significant economic losses for producers and for the industry. Genetic variability has been observed in M. hyopneumoniae using different techniques and heterogeneity of M. hyorhinis has been the focus of a limited number of studies in the past years. The fact that Mycoplasma genomes contain numerous repetitive regions (VNTR) within their DNA and that they are known to be active sites for genetic recombination has prompted the hypothesis that Multiple locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) would be an appropriate technique to investigate genetic variation in Mycoplasma. Therefore, the main goal of this dissertation was to investigate the non random distribution of genotypes from different geographical location using multiple locus variable tandem repeat analysis (MLVA) to type M. hyopneumoniae and M. hyorhinis and advance the knowledge on the genetic diversity and the epidemiology of these pathogens.When the M. hyopneumoniae study was taken in account, a high number of M. hyopneumoniae MLVA types appear to circulate among swine herds with a non-random distribution of the MLVA types among regions, also a common type was not identified among samples obtained from all regions in this study. Likewise, heterogeneity of M. hyorhinis was observed, with limited variation in one of the target VNTR in the M. hyorhinis study. A relevant point observed in this study was that different MLVA types were identified in the same animal in different sample types, which suggests that the pig was colonized with different strains. With a focus on Brazil pig industry, one of the most important in the world, a specific study observed a high heterogeneity of M. hyopneumoniae strains circulating in the country, and the comparison between the number of tandem repeats (TR) in RR1 P97 and RR3 P146 showed a significant negative correlation that may suggest a possible compensatory mechanism that would allow the bacterium to keep its full adhesion capacity even after reduction of TR in RR1-P97. In conclusion, the identification of the genetic heterogeneity of M. hyopneumoniae and M. hyorhinis will assist local epidemiological or outbreak investigations, design future control strategies as well as serve as a potential tool to study the evolutionary biology of this species.

Le « porcine respiratory disease complex » (PRDC) est un trouble multifactoriel dû à une infection simultanée ou séquentielle de divers micro-organismes pouvant intensifier ou prolonger les signes cliniques des porcs. On retrouve dans ce complexe Mycoplasma hyopneumoniae, un des agents initiateurs du PRDC et agent primaire de la pneumonie enzootique (EP) chez les porcs. Streptococcus suis est l’un des agents pathogènes secondaires du PRDC, c’est également un agent pathogène important induisant principalement des méningites, des septicémies et la mort subite des porcelets post-sevrés. Mycoplasma hyorhinis est également l’un des agents pathogènes secondaires du PRDC, et va induire des inflammations sérofibrineuses chez les porcelets. Comme ces trois pathogènes sont retrouvés au sein du PRDC et au niveau des voies respiratoires supérieures des porcs, il pourrait exister un effet positif des mycoplasmes sur la pathogénèse de S. suis. C’est pourquoi différentes expériences in vitro ont été réalisées avec les cellules épithéliales porcines (NPTr), les macrophages alvéolaires porcins (PAMs) et les cellules dendritiques porcines (BM-DCs) qui ont été pré-infectés par les mycoplasmes puis infectés avec S. suis. Il a été observé que la cytotoxicité et l’inflammation des cellules porcines ont été significativement augmentées lorsqu’elles ont été pré-infectées par les mycoplasmes puis infectées par S. suis. Cependant, la pré-infection des cellules n’a pas joué de rôle sur l’adhésion et l’invasion de S. suis, sur la phagocytose et la survie intracellulaire de la bactérie. Cette étude semble montrer que la pré-infection des mycoplasmes pourraient induire un contexte inflammatoire favorisant la pathogenèse de S. suis. / Porcine respiratory disease complex (PRDC) is a multifactorial disorder due to simultaneous or sequential infection with various microorganisms that can intensify or prolong clinical signs in pigs. Included in this complex is Mycoplasma hyopneumoniae, one of the initiating agents of PRDC and the primary agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs. Streptococcus suis is one of the secondary pathogens of PRDC and is also an important pathogen, mainly causing meningitis, septicemia, and sudden death in post-weaned piglets. Mycoplasma hyorhinis is also one of the secondary pathogens of PRDC and will also induce serofibrinous inflammation in piglets. As all three pathogens are found in the PRDC and in the upper respiratory tract of pigs there may be a positive effect of mycoplasma on the pathogenesis of S. suis. Therefore, different in vitro experiments were performed with newborn pig tracheal cells (NPTr), primary porcine alveolar macrophages (PAMs) and porcine bone-marrow-derived dendritic cells (BM-DCs) that were pre-infected with mycoplasma and then infected with S. suis. It was observed that cytotoxicity and inflammation of pig cells were significantly increased when they were pre-infected with mycoplasma and then infected with S. suis. However, pre-infection of the cells did not play a role in the adhesion and invasion of S. suis and in the phagocytosis and intracellular survival of the bacteria. This study suggests that pre-infection with mycoplasma may induce an inflammatory context favoring the pathogenesis of S. suis.