Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-03-27T11:13:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1553766 bytes, checksum: b606872a8ac311486f1471978c922ee9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T11:13:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1553766 bytes, checksum: b606872a8ac311486f1471978c922ee9 (MD5) Previous issue date: 2016-12-19 / A carne suína é a carne mais consumida no mundo. Como o suíno é o principal reservatório das estirpes patogênicas de Yersinia enterocolitica para o homem e como este micro-organismo possui a capacidade de se multiplicar em temperaturas de refrigeração, com isso, há necessidade de estudar diferentes mecanismos que possam controlar este patógeno. Uma alternativa para seu controle é mediante o uso de bacteriófagos. O objetivo desta pesquisa foi isolar, caracterizar e avaliar bacteriófagos para biocontrole de Y. enterocolitica em carne suína. Foram isolados seis bacteriófagos de fezes de aves, dos quais três foram selecionados para a realização dos experimentos: BFYe1, BFYe2 e BFYe6. Posteriormente, procederam-se à caracterização e avaliação dos bacteriófagos mediante a realização de testes de especificidade, morfologia e estabilidade. Também foram determinados os parâmetros cinéticos de adsorção e curva one step growth do bacteriófago BFYe6. Finalmente, foi realizada a avaliação do biocontrole do coquetel contendo os bacteriófagos em carne suína in natura. Os bacteriófagos em carne suína in natura. Os bacteriófagos foram específicos para Y. enterocolitica ATCC 9610 e foram classificados como pertencentes à ordem Caudovirales, família Myoviridae. O bacteriófago BFYe6 apresentou maior estabilidade na maioria das condições avaliadas, mas nenhum dos bacteriófagos manteve viabilidade nas condições de cozimento. O bacteriófago BFYe6 mostrou uma adsorção de 94,5 % no primeiro minuto, com período de latência de 55 min e a média do burts size de 10 a 11 UFP por célula infectada. A adição de coquetel de bacteriófagos na carne estocados a 4 °C, reduziram 0,60 e 0,81 ciclos logarítmicos nos T3 e T4 respectivamente até o dia 2, quando comparado com o controle (T2) no dia 0. Nos dias 5, 7 e 10, o T3 controlou a população de Y. enterocolitica, contrario ao T4 que controlou a bactéria até o dia 10. A 15 °C, até o dia 10 os bacteriófagos foram capazes de inibir significativamente o crescimento da bactéria. O controle na diminuição da bactéria no T3 foi de até 0,76 ciclos logarítmicos e no T4 de 1,05 ciclos logarítmicos no dia 10. O MOI não influenciou na efetividade da inibição. Conclui-se que os bacteriófagos apresentaram características favoráveis tais como infectividade, especificidade, estabilidade e potencial de biocontrole de Y. enterocolitica sob as condições de refrigeração da carne. / Pork is the most consumed meat in the world. As swine is the main reservoir of the pathogenic strains of Yersinia enterocolitica for humans, and as this microorganism has the capacity to multiply in temperatures if of refrigeration, with this there is a need to study different mechanisms that can control this pathogen. An alternative for its control is the using bacteriophages. The objective of this research was isolate, characterize and evaluate bacteriophage for biocontrol of Y. enterocolitica in pork meat. Were isolated six bacteriophages from chicken feces, of which three were selected for the experiments: BFYe1, BFYe2 and BFYe6. Subsequently, the characterization and evaluation of the bacteriophages were carried out by means of tests of specificity, morphology, and stability. It was also determined the kinetic parameters of adsorption and one-step growth curve of BFYe bacteriophage 6. Finally, we performed the evaluation of the biocontrol cocktail containing bacteriophages in fresh pork meat. The bacteriophages were specific to Y. enterocolitica (ATCC 9610) and were classified as belonging to the Caudovirales order, of Myoviridae family. The BFYe6 bacteriophage showed higher stability in most conditions evaluated, but none of the bacteriophages maintained viability under cooking conditions. The bacteriophage BFYe6 showed an adsorption of 94.5% in one minute, with a 55 min lag and the average bursts size 10 to 11 PFU per cell infected. The addition of a cocktail of bacteriophages, in the meat stored at 4 °C, reduced 0.60 and 0.81 log 10 units in T3 and T4 respectively until day 2, when compared with the T2 control at day 0. On days 5, 7 and 10 T3 controlled the Y. enterocolitica population more than T4 and significant differences in bacterial counts were observed in these treatments when compared to treatment without bacteriophage. On days 5, 7 and 10, T3 controlled the population of Y. enterocolitica, contrary to T4 that controlled the bacterium until day 10. At 15 ° C, until day 10 the bacteriophages were able to significantly inhibit the growth of the bacterium. At 15 °C, until day 10 bacteriophages were able to significantly inhibit bacterial growth. The control in the decrease of the bacterium in the T3 was of up to 0.76 log 10 units and in the T4 of 1,05 log 10 units in day 10. MOI did not influence the effectiveness of inhibition. It concludes that the bacteriophages presented favorable characteristics such as infectivity, specificity, stability and potential of biocontrol of Y. enterocolitica under cooling conditions of the meat.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-18T09:46:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 926264 bytes, checksum: 416b10a79cd9725bb4a42f91379a81ee (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-18T09:46:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 926264 bytes, checksum: 416b10a79cd9725bb4a42f91379a81ee (MD5) Previous issue date: 2015-08-14 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio / As duas espécies de Mycoplasma mais prevalentes na indústria suinícola são Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma hyorhinis. Estes patógenos podem causar perdas econômicas significativas para os produtores e para a indústria. Variabilidade genética tem sido observada em cepas de M. hyopneumoniae usando diferentes técnicas de tipificação. Já a diversidade genética de M. hyorhinis tem sido o foco de um número limitado de estudos nos últimos anos. Mycoplasma apresentam numerosas regiões repetitivas (VNTR) no seu genoma, e essas regiões repetitivas são conhecidos por serem sítios ativos para recombinação genética. Isso trouxe em evidencia a hipótese de que a análise em multilocus de repetições em Tandem de número variável (MLVA) seria uma técnica adequada para investigar a variação genética em Mycoplasma. Portanto, o objetivo principal desta dissertação foi investigar a distribuição não aleatória dos genótipos de diferentes localizações geográfica usando análise em multilocus de repetições em Tandem de número variável (MLVA) para tipificar M. hyopneumoniae e M. hyorhinis avançando o conhecimento sobre a diversidade genética e epidemiologia desses agentes. Quando o foco foi o estudo da diversidade genética de M. hyopneumoniae, um elevado número de tipos de MLVA parecem circular entre rebanhos de suínos com uma distribuição não aleatória dos tipos de MLVA entre regiões. Um único tipo comum não foi identificado entre as amostras obtidas a partir de todas as regiões em estudo. Do mesmo modo, foi observada a diversidade genética de M. hyorhinis, com uma variação limitada em um dos VNTRs alvo. Um ponto relevante observado neste estudo foi a identificação de diferentes tipos de MLVA no mesmo animal em diferentes tipos de amostras, o que sugere que o animal foi colonizado por diferentes cepas. Com foco na indústria de suínos do Brasil, uma das mais importantes do mundo, um estudo específico observou uma elevada diversidade de cepas de M. hyopneumoniae em circulação no país. A comparação entre o número de repetições em tandem (TR) no P97 RR1 e RR3 P146 mostrou uma correlação negativa significativa o que pode sugerir um possível mecanismo compensatório que permitiria a bactéria manter sua capacidade de aderência completa mesmo após a redução da TR em RR1-P97. Em conclusão, a identificação da heterogeneidade genética de M. hyopneumoniae e M. hyorhinis ajudará investigações epidemiológicas ou de surtos locais e ajudará conceber estratégias de controle futuras, bem como servir como uma ferramenta potencial para o estudo da biologia evolutiva da espécie. / The two most prevalent Mycoplasmas species present in the swine industry are Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis. These pathogens can cause significant economic losses for producers and for the industry. Genetic variability has been observed in M. hyopneumoniae using different techniques and heterogeneity of M. hyorhinis has been the focus of a limited number of studies in the past years. The fact that Mycoplasma genomes contain numerous repetitive regions (VNTR) within their DNA and that they are known to be active sites for genetic recombination has prompted the hypothesis that Multiple locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) would be an appropriate technique to investigate genetic variation in Mycoplasma. Therefore, the main goal of this dissertation was to investigate the non random distribution of genotypes from different geographical location using multiple locus variable tandem repeat analysis (MLVA) to type M. hyopneumoniae and M. hyorhinis and advance the knowledge on the genetic diversity and the epidemiology of these pathogens.When the M. hyopneumoniae study was taken in account, a high number of M. hyopneumoniae MLVA types appear to circulate among swine herds with a non-random distribution of the MLVA types among regions, also a common type was not identified among samples obtained from all regions in this study. Likewise, heterogeneity of M. hyorhinis was observed, with limited variation in one of the target VNTR in the M. hyorhinis study. A relevant point observed in this study was that different MLVA types were identified in the same animal in different sample types, which suggests that the pig was colonized with different strains. With a focus on Brazil pig industry, one of the most important in the world, a specific study observed a high heterogeneity of M. hyopneumoniae strains circulating in the country, and the comparison between the number of tandem repeats (TR) in RR1 P97 and RR3 P146 showed a significant negative correlation that may suggest a possible compensatory mechanism that would allow the bacterium to keep its full adhesion capacity even after reduction of TR in RR1-P97. In conclusion, the identification of the genetic heterogeneity of M. hyopneumoniae and M. hyorhinis will assist local epidemiological or outbreak investigations, design future control strategies as well as serve as a potential tool to study the evolutionary biology of this species.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-05T18:15:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 693325 bytes, checksum: 2afbc494cbadf4704a75769d027d64d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T18:15:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 693325 bytes, checksum: 2afbc494cbadf4704a75769d027d64d1 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, uma severa enfermidade que acomete suínos de todas as idades, gerando perdas econômicas significativas para a suinocultura mundial. Embora os 15 sorotipos conhecidos dessa bactéria possam causar a doença, existem diferenças marcantes de virulência entre eles. A virulência de A. pleuropneumoniae é multifatorial e está relacionada à composição e estrutura de polissacarídeos da cápsula, LPS, e toxinas da família RTX, além desses fatores, a aderência em forma de biofilme e a resistência a agentes antimicrobianos podem ser determinantes para virulência. Este trabalho estabeleceu um modelo de infecção alternativo para o estudo de A. pleuropneumoniae, utilizando larvas de Galleria mellonella e, posteriormente esse modelo foi usado para investigar a virulência de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8. Os mesmos isolados foram avaliados quanto ao potencial de formação de biofilme e resistência a antimicrobianos comumente empregados em campo. A partir dessas informações, isolados clínicos com diferenças significativas na virulência, no potencial de formação de biofilme e no perfil de resistência foram selecionados para o sequenciamento genômico. Os resultados mostraram que o modelo de infecção A. pleuropneumoniae – G. mellonella é capaz de diferenciar níveis de virulência de isolados clínicos de mesmo sorotipo, além de permitir a avaliação da eficiência de agentes antimicrobianos contra este patógeno. O modelo também mostrou eficiência para diferenciar virulência entre linhagens selvagem e mutante da mesma bactéria. Uma análise de correlação entre os dados de virulência, formação de biofilme e resistência a antimicrobianos permitiu que seis isolados fossem selecionados para o sequenciamento. Com a montagem e anotação foi possível verificar que os genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 apresentam tamanho de 2,2 ± 0,004 Mpb, com o conteúdo GC de 40,33% ± 0,263 e regiões codificadoras com uma média de tamanho de 817,3 ± 6,8 pb. As regiões codificadoras correspondem a 89,05% ± 0,13 do genoma, das quais a maior parte foi anotada como genes funcionais, o que permitirá a realização de estudos comparativos. Estes genomas apresentam em média 79,5 ± 24,05 genes exclusivos, revelando a alta variabilidade genética dessa espécie, que pode estar relacionada com a variação da virulência entre os isolados estudados. / Actinobacillus pleuropneumoniae is the etiological agent of porcine pleuropneumonia, a severe disease that affects pigs of all ages, causing significant economic losses to the swine industry worldwide. Although the 15 serotypes of this bacterium are known to cause the disease, there are marked differences in virulence between them. A. pleuropneumoniae virulence is multifactorial and involves capsular polysaccharides, LPS, and toxins of the RTX family. In addition to these factors, the adhesion in biofilm form and resistance to antimicrobial agents may be determinant for virulence. This work has established an alternative infection model for the study of A. pleuropneumoniae, using larvae of Galleria mellonella and this model was subsequently used to investigate the virulence of clinical isolates of A. pleuropneumoniae serotype 8. The same isolates were evaluated for biofilm formation potential and resistance to antimicrobials commonly used in the field. From this information, clinical isolates with significant differences in virulence, biofilm formation potential and resistance profile were selected for genomic sequencing. Results show that the A. pleuropneumoniae - G. mellonella infection model is capable of differentiating levels of virulence of clinical isolates of the same serotype. Furthermore, it can be used to evaluate the effectiveness of antimicrobial agents against this pathogen. The model also showed efficiency to differentiate the virulence between wild and mutant strains of the same bacteria. A correlation analysis between the virulence data, biofilm formation and antibiotic resistance allowed six isolates to be selected for genome sequencing. With the assembly and annotation, we found that the genomes of A. pleuropneumoniae serotype 8 present size of 2.2 ± 0.004 Mpb, with GC content of 40.33% ± 0.263 and coding regions with an average size of 817.3 ± 6.8 bp. The coding regions correspond to 89.05 ± 0.13% of the genome, most of which was recorded as functional genes, enabling the comparative studies with these genomes. These genomes have 79.5 ± 24.05 exclusive proteins, revealing the high genetic variability of the species, which may be related to the variation in virulence between these isolates.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV06MA010.pdf: 5309258 bytes, checksum: 0c98675b5eb134038631461c4ac02a50 (MD5) Previous issue date: 2006-03-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) is a multifactorial disease caused by a Porcine Circovirus Type 2 (PCV-2). It is clinically characterized by wasting, enlargement of lymph nodes, pallor, jaundice, and respiratory and digestive signs. The lesions affect mainly lymphoid tissues, lungs, kidneys and liver. Pathological findings consist of lymphohistiocytic infiltration of various organs and depletion of lymphoid follicles. However, to establish the conclusive diagnosis of PMWS, it is necessary the association of clinical signs, gross and microscopic lesions, besides the evidence of the antigen or viral DNA. Thus, the aim of this work was to establish two techniques of diagnosis: immunocitochemistry (ICC) in two cell lines (ST and VERO), using two types of primary antibodies against PCV-2 (a polyclonal produced in rabbit and a polyclonal produced in pig), to determine antibodies against PCV-2 in swine serum, and immunohistochemistry (IHC) in various parraffined swine tissues (lymph node, lung, liver, thymus, kidney and intestine), using two types of primary antibodies (a monoclonal produced in mouse and a polyclonal produced in rabbit) to show the viral antigen. In ICC, both cells cultures were susceptible to infection, where the antigen could be detected in the nucleum as much as in cytoplasm of the cells, with both primary antibodies. The IHC was established in the different tissues with both antibodies, where the antigen was verified mainly in macrophages, histiocytes and others inflammatory cells. Intending to verify the transmission of PCV-2 by semen and its infection power to the sow and to the piglets, 20 negative sows to PCV-2 were inseminated, 10 with a negative boar semen and 10 sows with a positive boar semen. After the insemination, the 20 sows were clinically attended and blood was collected to PCV-2 DNA investigation by nested-PCR. Based on the results, 4 sows between the 20 were selected (1 sow was serum negative inseminated with a negative semen, 2 sows were serum negative inseminated with a positive semen and 1 sow was serum negative inseminated with a positive semen, but serum converted around the 30 days of pregnancy). After the parturition, 12 male piglets, 3 of each sow, were selected and isolated. Samples of semen and serum were collected to PCV-2 DNA investigation by nested-PCR. Intending to verify which organs shelter the PCV-2, the piglets were submitted to euthanasia around 9 months of age, and samples of lymphoid, systemic and reproductive organs were collected to investigation by nested-PCR, histopathology (HE) and IHC. Evaluating the serum by ICC, all 12 piglets serum converted (4 were strongly positive, 3 were moderate positive and 5 were weakly positive). Evaluating the samples by nested-PCR, various tissues were positive in 10 of 12 piglets. Evaluating the same samples by IHQ, various samples were positive in 8 of 12 piglets. In general, the results had, in different samples, in the 4 tests (ICC, nested-PCR, HE and IHC) completed themselves. Thus, these results show the probable PCV-2 semen transmission to the piglets and also the infectious potential among pigs / A Síndrome Multissistêmica do Definhamento do Suíno (SMDS) é uma doença multifatorial, causada pelo Circovirus Suíno Tipo 2 (PCV-2). Clinicamente está caracterizada por definhamento, aumento de tamanho dos linfonodos, palidez e/ou icterícia e sinais digestivos e respiratórios. As lesões afetam principalmente tecidos linfóides, pulmão, rim e fígado. Os achados microscópicos consistem principalmente em infiltração linfo-histiocitária em vários órgãos e depleção dos folículos linfóides. Entretanto, para estabelecer o diagnóstico conclusivo da SMDS, é necessário associar sinais clínicos, lesões macroscópicas e microscópicas, além da demonstração do antígeno ou DNA viral. Assim, o objetivo deste trabalho foi padronizar duas técnicas de diagnóstico: imunocitoquímica (ICQ) em duas linhagens celulares (ST e VERO), utilizando dois tipos de anticorpos primários anti PCV-2 (policlonal produzido em coelho e policlonal produzido em suíno) para determinação de anticorpos anti PCV-2 em soro suíno e, imunohistoquímica (IHQ) em diversos tecidos parafinizados de suínos (linfonodo, pulmão, fígado, timo, rim e intestino), utilizando dois tipos de anticorpos primários (monoclonal produzido em camundongo e policlonal produzido em coelho) para demonstração do antígeno viral. Na ICQ, ambos cultivos celulares foram suscetíveis à infecção, podendo-se detectar o antígeno tanto no núcleo quanto no citoplasma das células, com os dois anticorpos primários. A IHQ foi padronizada nos diversos tecidos com os dois anticorpos, sendo que o antígeno foi verificado principalmente em macrófagos, histiócitos e outras células inflamatórias. Com o objetivo de verificar a transmissão via sêmen de PCV-2 e sua capacidade infecciosa para a fêmea e para a progênie, 20 fêmeas negativas para PCV-2 foram inseminadas, 10 com sêmen de macho negativo e 10 com sêmen de macho positivo. Após a inseminação, as 20 fêmeas foram acompanhadas clinicamente e foi coletado sangue para pesquisa de DNA de PCV-2 por nested-PCR . Baseado no resultado, 4 fêmeas das 20 foram selecionadas (1 fêmea soronegativa inseminada com sêmen negativo, 2 fêmeas soronegativas inseminadas com sêmen positivo e 1 fêmea soronegativa inseminada com sêmen positivo, mas que soroconverteu ao redor dos 30 dias de gestação). Após o parto, 12 leitões machos, 3 de cada fêmea, foram selecionados e mantidos em isolamento. Amostras de sêmen e soro foram coletadas para pesquisa de DNA de PCV-2 por nested-PCR . Para verificar quais órgãos abrigam o PCV-2, os leitões sofreram eutanásia ao redor dos nove meses de idade, e amostras de órgãos linfóides, sistêmicos e reprodutivos foram coletadas para avaliação por nested-PCR , histopatologia (HE) e IHQ. Ao avaliar o soro por ICQ, todos os 12 leitões soroconverteram (4 foram fortemente positivos, 3 moderadamente positivos e 5 fracamente positivos). Ao avaliar as amostras por nested-PCR , vários tecidos foram positivos em 10 dos 12 suínos. Ao avaliar as mesmas amostras por IHQ, várias foram positivas em 8 dos 12 suínos. No geral, os resultados obtidos nas diferentes amostras nos 4 testes (ICQ, nested-PCR , HE e IHQ) colaboraram entre si. Assim, estes resultados evidenciam a provável transmissão do PCV-2 pelo sêmen para a leitegada e também o potencial infeccioso do vírus entre os suínos